Evolución en el laboratorio de la hidroxilación del citocromo P450 mediada por peróxido

Área de la Ciencia:

• La bioquímica es la bioquímica.
• Enzimología Enzimología.
• La biocatálisis por biocatálisis.

Sus antecedentes:

• Las reacciones catalizadas por enzimas ofrecen una alta selectividad en condiciones suaves, crucial para las industrias farmacéutica y química.
• Las monooxigenasas del citocromo P450 (P450s) son enzimas vitales para la desintoxicación y la esteroideogénesis, con aplicaciones potenciales en síntesis y remediación.
• Las limitaciones de los P450 nativos incluyen bajas tasas de rotación, poca estabilidad y dependencia de cofactores, lo que dificulta su uso práctico.

Objetivo del estudio:

• Mejorar la actividad catalítica y la independencia del cofactor de las enzimas P450 para la biocatálisis industrial.
• Desarrollar un método de cribado de alto rendimiento para identificar mutantes mejorados del P450.

Principales métodos:

• La evolución dirigida se empleó para diseñar el P450 a partir de Pseudomonas putida.
• Se desarrolló un nuevo sistema de cribado que involucra la coexpresión con la peroxidasa de rábano picante para detectar la mejora de la actividad enzimática a través de la fluorescencia.
• Los mutantes fueron seleccionados para una mayor actividad de hidroxilación de naftaleno a través de la vía de derivación de peróxido.

Principales resultados:

• Los mutantes modificados de P450 exhibieron una actividad más de 20 veces mayor en la hidroxilación del naftaleno en comparación con la enzima nativa.
• Los mutantes desarrollados funcionan eficazmente en ausencia de los cofactores donantes de electrones tradicionales.
• El sistema de cribado permitió la identificación eficiente de las variantes P450 altamente activas.

Conclusiones:

• La evolución dirigida creó con éxito mutantes P450 con una actividad significativamente mejorada y independencia del cofactor.
• La plataforma de cribado desarrollada es efectiva para seleccionar mono- y di-oxigenasas mejoradas.
• Estas enzimas de ingeniería se muestran prometedoras como biocatalizadores prácticos para la hidroxilación de diversos compuestos aromáticos.