Los andamios de los inhibidores como nuevos sustratos de la quinasa específica del alelo

Área de la Ciencia:

• La bioquímica es la bioquímica.
• Biología Molecular Biología Molecular
• Biología Química Biología química.

Sus antecedentes:

• La superfamilia de la proteína quinasa es vasta (>500 quinasas humanas), por lo que la aclaración de las redes de señalización es un desafío.
• Los métodos existentes para la investigación de la quinasa se enfrentan a limitaciones en cuanto a especificidad y eficiencia.
• El etiquetado específico de los sustratos de proteínas quinasa es crucial para comprender la señalización celular.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar una nueva clase de análogos ortogonales de sustrato de trifosfato para el etiquetado directo de objetivos específicos de proteínas quinasa.
• Evaluar la especificidad del sustrato y la eficiencia catalítica de estos nuevos análogos en comparación con el ATP.
• Para demostrar la utilidad de estos análogos para el etiquetado de la quinasa en muestras biológicas complejas.

Principales métodos:

• Síntesis de análogos de sustratos de trifosfato ortogonales, incluido el trifosfato de 3-benzilpirazolopirimidina (3-benzil-PPTP), basado en estructuras PP1 del inhibidor de la quinasa de la familia Src.
• Ensayos enzimáticos para determinar la preferencia de sustrato y la eficiencia catalítica (kcat/KM) de 3-benzil-PPTP para varias quinasas, incluidas las mutantes p38, v-Src y CDK2/ciclina E.
• Experimentos de etiquetado de sustrato de proteína quinasa utilizando [gamma-(32) P]-3-benzil-PPTP en lisatos celulares de esplenocitos murinos para evaluar la ortogonalidad y la eficiencia frente a las quinasas de tipo salvaje y los niveles celulares de ATP.

Principales resultados:

• Se descubrió que el 3-benzil-PPTP era un sustrato para el mutante p38 y fue preferido por v-Src (T338G) sobre el ATP y el N(6)-(benzil) -ATP.
• Para CDK2 (F80G) / ciclina E, el 3-benzil-PPTP exhibió una eficiencia catalítica comparable a la del ATP, principalmente debido a una K (M) significativamente menor.
• Tanto el 3-benzil-PPTP como el 3-fenil-PPTP demostraron más de 4 veces mayor ortogonalidad que el N(6)-(benzil) -ATP en el etiquetado de las quinasas de tipo salvaje de los esplenocitos murinos.
• [gamma-(32) P]-3-benzil-PPTP efectivamente etiquetado sustratos proteicos directos de CDK2 (F80G) / E en lisatos celulares, incluso con altas concentraciones celulares de ATP.

Conclusiones:

• Se ha desarrollado una nueva clase de análogos de sustrato de trifosfato altamente ortogonales para el etiquetado específico de la quinasa.
• Estos análogos exhiben una amplia aceptación de sustratos en todas las quinasas divergentes, lo que sugiere una potencial generalización a toda la superfamilia de las quinasas.
• Los análogos desarrollados ofrecen una poderosa herramienta para diseccionar redes de señalización de kinasa e identificar sustratos directos de kinasa en sistemas celulares complejos.