De gen a HSQC en menos de cinco horas: proteómica de RMN de alto rendimiento

Área de la Ciencia:

• La bioquímica es la bioquímica.
• Biología Estructural Biología estructural.
• Biología Molecular Biología Molecular

Sus antecedentes:

• La espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) es crucial para determinar las estructuras de las proteínas en solución.
• Expresar y purificar proteínas, especialmente aquellas con una solubilidad limitada como SUMO-1, puede llevar mucho tiempo y ser un desafío para los estudios de RMN.
• La evaluación rápida de la idoneidad de la proteína para la determinación estructural es esencial para flujos de trabajo de investigación eficientes.

Objetivo del estudio:

• Introducir y validar el sistema de RMN Expressway, un método de expresión de proteínas libre de células.
• Para demostrar la eficiencia del sistema en la producción de una proteína desafiante (SUMO-1) para el análisis de RMN.
• Para establecer un flujo de trabajo rápido del gen a los datos de RMN de alta resolución.

Principales métodos:

• Utilizó el sistema libre de células Expressway NMR para la expresión de proteínas in vitro.
• Proteína SUMO-1 enriquecida isotópicamente con nitrógeno-15 expresado.
• Espectro de Coherencia Cuántica Heteronuclear Única (HSQC) 2D adquirido utilizando secuencias de pulso optimizadas y el método de procesamiento de diagonalización de filtro (FDM).
• Estabilidad de la muestra evaluada a lo largo del tiempo.

Principales resultados:

• Se logró la producción a escala miligrámica de la proteína SUMO-1 en 4 horas.
• Obtuvo espectros 2D HSQC de alta resolución en tan solo 40 minutos (o 10 minutos con sondas avanzadas).
• Completó todo el proceso desde el gen hasta el espectro HSQC en 5-6 horas, incluida la purificación y el procesamiento de datos.
• Demostró una notable estabilidad de la muestra durante más de 6 meses a 4°C.

Conclusiones:

• El sistema de RMN Expressway proporciona un método rápido, de alto rendimiento y libre de proteasas para la expresión de proteínas.
• Este enfoque libre de células reduce significativamente el tiempo requerido para obtener muestras de proteínas listas para RMN.
• El sistema es una herramienta atractiva para evaluar rápidamente la idoneidad de la proteína para la determinación de la estructura de la solución completa.