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Updated: Jul 9, 2026
07:12
Time-resolved Förster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells
Published on: September 9, 2021
Ensayos de una sola etiqueta de quinasa y fosfatasa para la fosforilación de tirosina utilizando detección de
Harekrushna Sahoo1, Andreas Hennig, Mara Florea
1School of Engineering and Science, Jacobs University Bremen, Campus Ring 1, D-28759 Bremen, Germany.
Journal of the American Chemical Society
|November 30, 2007
Resumen
Un nuevo ensayo que utiliza el 2,3-diazabiciclo[2.2.2]oct-2-eno (Dbo) para la disminución de la fluorescencia mide la actividad de la tirosina quinasa y la fosfatasa. Este método ofrece alta sensibilidad y amplia aplicabilidad para el monitoreo de la actividad enzimática y la detección de inhibidores.
Área de la Ciencia:
- La bioquímica es la bioquímica.
- La cinética de las enzimas.
- Espectroscopía de fluorescencia por fluorescencia.
Sus antecedentes:
- Las tirosinacinasas y las fosfatasas son reguladores cruciales de la señalización celular.
- Los ensayos existentes para estas enzimas tienen limitaciones en sensibilidad y alcance.
- Se necesita una estrategia de etiquetado único para una evaluación robusta de la actividad enzimática.
Objetivo del estudio:
- Introducir y validar un nuevo ensayo de apagado de fluorescencia para la actividad de la tirosina quinasa y la fosfatasa.
- Para demostrar la amplia aplicabilidad de este ensayo a través de varias combinaciones de enzimas y sustratos.
- Para explorar el potencial de este ensayo para el cribado de inhibidores.
Principales métodos:
- Etiquetado de los residuos de asparagina en sustratos de péptidos con 2,3-diazabiciclo[2.2.2]oct-2-eno (Dbo).
- Monitoreo del apagado de fluorescencia inducido por colisión a través de la abstracción de átomos de hidrógeno.
- Utilizando tanto la detección de fluorescencia en estado estacionario como la detección de fluorescencia con resolución en tiempo de nanosegundos (Nano-TRF).
Principales resultados:
- El ensayo etiquetado con Dbo demostró cambios significativos de fluorescencia (hasta 7 veces) durante las reacciones enzimáticas.
- El ensayo mostró una amplia aplicabilidad con 12 combinaciones de sustrato y enzima, incluidas la Src quinasa, la EGFR quinasa y varias fosfatasas.
- La fluorescencia con resolución de tiempo de nanosegundos (Nano-TRF) mejora la sensibilidad y la discriminación de fondo.
- El molibdato se identificó como un inhibidor de las fosfatasas ácidas y alcalinas utilizando este ensayo.
Conclusiones:
- El ensayo de apagado de fluorescencia Dbo es una herramienta sensible y versátil para medir la actividad de la tirosina quinasa y la fosfatasa.
- La capacidad del ensayo para utilizar la detección Nano-TRF mejora el rendimiento y amplía su utilidad.
- Este método tiene un potencial significativo para el cribado de alto rendimiento de inhibidores de enzimas.
