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Updated: Jul 8, 2026

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

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Published on: April 27, 2018

Un aceptador de protones alternativo para la transferencia de protones en estado excitado en proteínas fluorescentes

Deborah Stoner-Ma¹, Andrew A Jaye, Kate L Ronayne

¹Department of Chemistry, Stony Brook University, Stony Brook, New York 11794-3400, USA.

Journal of the American Chemical Society

|January 9, 2008

Resumen

Las mutaciones de la proteína verde fluorescente (GFP) pueden restaurar la fluorescencia al permitir la transferencia de protones en estado excitado (ESPT). Un mecanismo de enlace de hidrógeno de baja barrera que involucra a D148 explica la recuperación de la fluorescencia en mutantes dobles, simplificando los requisitos de transferencia de protones de proteínas.

Área de la Ciencia:

La biofísica es la biofísica.
Ingeniería de proteínas Ingeniería de proteínas.
La espectroscopia es una técnica de espectroscopia.

Sus antecedentes:

La fluorescencia de la proteína verde fluorescente de tipo salvaje (wtGFP) se basa en la transferencia de protones en estado excitado (ESPT) desde su cromóforo.
Las mutaciones como S65T y E222Q interrumpen la ESPT, lo que lleva a la pérdida de fluorescencia.
Estudios previos mostraron que la mutación H148D puede restaurar la fluorescencia verde en S65T GFP.

Objetivo del estudio:

Investigar el mecanismo de recuperación de la fluorescencia en los mutantes S65T/H148D y E222Q/H148D del GFP.
Explorar el papel de D148 como aceptador de protones en el ESPT.
Elucidar la dinámica de transferencia de protones y el enlace de hidrógeno en estos GFP diseñados.

Principales métodos:

Espectroscopia de fluorescencia de estado estacionario y ultrarrápida con resolución temporal.
Espectroscopia vibratoria de infrarrojos (TRIR) con resolución de tiempo. espectroscopia vibratoria de infrarrojos (TRIR) con resolución de tiempo. espectroscopia vibratoria de infrarrojos (TRIR) con resolución de tiempo. espectroscopia vibratoria de infrarrojos (TRIR) con resolución de tiempo.
Análisis de los mutantes dobles (S65T/H148D y E222Q/H148D) en comparación con los mutantes únicos y el wtGFP.

Principales resultados:

Formación rápida (<1 ps) del estado I* observada en mutantes dobles, seguida de un enfriamiento por vibración en picosegundos.
Los espectros de TRIR difieren significativamente de los de los mutantes wtGFP y aniónicos.
No hay evidencia espectral de cambios en el estado de ionización de D148, lo que sugiere un enlace de hidrógeno de baja barrera (LBHB).

Conclusiones:

Un LBHB entre el cromóforo y D148 facilita la ESPT en los mutantes dobles.
Este mecanismo explica la recuperación de la fluorescencia y está respaldado por datos estructurales (< 2,4 Å distancia).
Un solo residuo puede reemplazar la compleja red de enlaces de hidrógeno para la transferencia de protones, avanzando en la comprensión de la dinámica de las proteínas.

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