Estructura del estado de transición para la hidrólisis del NAD catalizado por la toxina de la difteria

Área de la Ciencia:

• La bioquímica es la bioquímica.
• Enzimología Enzimología.
• Toxicología Toxicología.

Sus antecedentes:

• La toxina de difteria (DTA) cataliza la ADP-ribosilación del factor de alargamiento eucariótico 2 utilizando NAD ((+)) como sustrato.
• En ausencia de su aceptor fisiológico, el DTA hidroliza el NAD ((+) a ADP-ribosa y nicotinamida.
• Esta reacción de hidrólisis proporciona una vía para estudiar el mecanismo catalítico de la enzima a través de los efectos de isótopos cinéticos (KIEs).

Objetivo del estudio:

• Determinar la estructura del estado de transición de la hidrólisis de NAD (((+) catalizada por DTA.
• Para dilucidar el mecanismo de la hidrólisis de NAD (((+) catalizada por DTA utilizando mediciones del efecto isotópico cinético (KIE).
• Comprender cómo la DTA estabiliza el estado de transición a través de interacciones enzimáticas.

Principales métodos:

• Medición de los efectos de isótopos cinéticos competitivos (KIEs) para las moléculas de NAD isotópicamente etiquetadas con el método radiolabel.
• Determinación del oxígeno en el anillo (4'-(18) O) KIE utilizando espectrometría de masa de molécula completa.
• Interpolación de la estructura y análisis vibratorio de la energía de enlace / límite de enlace para predecir KIEs para las estructuras de estado de transición de prueba.
• Ajuste de la estructura de estado de transición determinada a la estructura cristalográfica de rayos X de DTA.

Principales resultados:

• Se midieron múltiples KIE para varias posiciones etiquetadas NAD(+), con valores significativos observados para 1'-(3) H (1.200 ± 0.005) y 2'-(3) H (1.142 ± 0.005).
• El KIE de 4'-(18) O, medido tanto por radiomarcador como por espectrometría de masas, tuvo un promedio de 0.988 ± 0.003.
• Los KIEs experimentales coincidieron con las predicciones para un estado de transición concertado, altamente similar a los iones de oxocarbenio, con órdenes de enlace residual de 0,02 para el grupo de salida y 0,03 para el nucleófilo (mecanismo A(N) D(N).
• El ajuste del estado de transición en el sitio activo de la DTA reveló mecanismos de estabilización que incluyen la desolución del anillo de nicotinamida y las interacciones electrostáticas.

Conclusiones:

• El DTA cataliza la hidrólisis de NAD (((+) a través de un mecanismo concertado A (((N) D (((N) que involucra tanto el grupo de salida como la participación nucleofílica.
• El estado de transición es muy similar al ion oxocarbenio, estabilizado por interacciones enzimáticas específicas dentro del sitio activo de la DTA.
• Estos hallazgos proporcionan información detallada sobre el mecanismo catalítico y la estabilización del estado de transición de la hidrólisis de NAD (((+) mediada por DTA.