Expandir la química del ADN para la selección in vitro

Área de la Ciencia:

• La bioquímica es la bioquímica.
• Biología Molecular Biología Molecular
• Química sintética de la química sintética.

Sus antecedentes:

• La selección in vitro es un método poderoso para descubrir aptameros de ADN.
• Ciertos blancos de proteínas, como TNFRSF9, han sido refractarios a los métodos tradicionales de selección in vitro utilizando desoxinucleótidos estándar.
• Los derivados del trifosfato de desoxinucleótido modificado (dUTP) ofrecen el potencial para superar tales limitaciones.

Objetivo del estudio:

• Para sintetizar y evaluar nuevos derivados de dUTP modificados en 5 posiciones para la selección in vitro.
• Evaluar la compatibilidad de estos dUTP modificados con la síntesis enzimática de ADN, incluida la PCR y la extensión del primer.
• Determinar si los dUTP modificados pueden permitir la selección de aptameros de ADN contra el objetivo previamente intratable TNFRSF9.9.

Principales métodos:

• Síntesis de seis nuevos derivados de dUTP modificados en 5 posiciones con un enlace amídico.
• Prueba de la capacidad de seis polimerasas de ADN comerciales para incorporar estos dUTP modificados durante la PCR y las reacciones de extensión de primer.
• Realización de experimentos de selección in vitro utilizando bibliotecas de ADN modificadas contra TNFRSF9, comparando los resultados con el trifosfato de desoxinucleótido estándar (TTP).

Principales resultados:

• Los dUTP modificados no eran compatibles con las condiciones estándar de PCR, pero se incorporaron con éxito durante las reacciones de extensión del primer.
• Las polimerasas de ADN KOD XL y D. Vent mostraron una alta eficiencia en la síntesis de productos de extensión de primer de longitud completa con dUTP modificados.
• La selección in vitro utilizando bibliotecas de ADN modificadas produjo los primeros aptameros de ADN de alta afinidad para TNFRSF9, un objetivo previamente resistente a la selección de aptameros.

Conclusiones:

• Los nuevos derivados de dUTP modificados en 5 posiciones pueden utilizarse eficazmente en las reacciones de extensión de primeras.
• Estos dUTP modificados permiten una selección exitosa in vitro de los aptameros de ADN contra objetivos proteicos difíciles como el TNFRSF9.9.
• Los dUTPs modificados desarrollados representan un avance significativo para el descubrimiento de aptameros contra objetivos previamente intratables.