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Nuevos sustratos fluorogénicos para el análisis de las proteasas retrovirales por transferencia de energía de
E D Matayoshi1, G T Wang, G A Krafft
1Pharmaceutical Discovery Division, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL 60064.
Science (New York, N.Y.)
|February 23, 1990
Resumen
Se desarrolló un nuevo ensayo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (RET) para medir la actividad de la proteasa 1 del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1 PR). Este ensayo permite la identificación rápida de nuevos fármacos terapéuticos para el SIDA mediante el monitoreo del procesamiento de la poliproteína viral.
Área de la Ciencia:
- La bioquímica es la bioquímica.
- Biología Molecular Biología Molecular
- Descubrimiento de Drogas Descubrimiento de Drogas
Sus antecedentes:
- La proteasa 11-kD (PR) del virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) es crucial para la maduración viral y un objetivo clave para las terapias del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
- Los métodos existentes para estudiar la actividad PR del VIH-1, como la HPLC y la electroforesis, requieren mucho tiempo y son menos precisos para el análisis cinético.
Objetivo del estudio:
- Desarrollar un nuevo ensayo continuo para la actividad PR del VIH-1 utilizando la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia intramolecular (RET).
- Facilitar el descubrimiento de nuevos inhibidores PR del VIH-1 y permitir estudios enzimáticos detallados.
Principales métodos:
- Se sintetizó un sustrato fluorogénico apagado (DABCYL-Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln-EDANS) derivado de un sitio natural de procesamiento de PR del VIH-1.
- El ensayo mide aumentos dependientes del tiempo en la intensidad de fluorescencia resultante de la escisión específica del sustrato por el VIH-1 PR.
- Un sustrato similar fue diseñado para la proteasa relacionada con el virus de la mieloblastosis aviar (VMA).
Principales resultados:
- El ensayo RET demostró la escisión específica del sustrato en el enlace Tyr-Pro por HIV-1 PR, lo que lleva a un aumento lineal de la fluorescencia.
- El ensayo mostró un aumento de 40,0 veces en el rendimiento cuántico de fluorescencia por mol de sustrato escindido para HIV-1 PR.
- Se observó un aumento de 34,4 veces en el rendimiento cuántico de fluorescencia para el sustrato AMV PR.
Conclusiones:
- El ensayo basado en RET desarrollado es simple, rápido y preciso para determinar las tasas de reacción de las proteasas retrovirales.
- Este método ofrece ventajas significativas sobre los ensayos tradicionales de HPLC y electroforesis para la determinación de la actividad PR del VIH-1.
- El ensayo es valioso para el análisis cinético, la detección de inhibidores y la enzimología detallada de las proteasas virales.