Una proteína fluorescente naranja con un gran desplazamiento de Stokes para FCCS multicolor de excitación única y...

Área de la Ciencia:

• Imágenes celulares y moleculares.
• La biofísica es la biofísica.
• Ingeniería de proteínas Ingeniería de proteínas.

Sus antecedentes:

• Las proteínas fluorescentes genéticamente codificadas (FP) son herramientas vitales para los estudios de procesos dinámicos de células vivas.
• Las paletas de FP existentes tienen brechas espectrales, lo que limita las capacidades de imagen multicolor.

Objetivo del estudio:

• Introducir un nuevo FP monomérico naranja con un gran desplazamiento de Stokes (LSS), llamado LSSmOrange.
• Demostrar la utilidad de LSSmOrange en aplicaciones avanzadas de imágenes multicolores y análisis de moléculas individuales.

Principales métodos:

• Desarrollo y caracterización de LSSmOrange (excitación/emisión a 437/572 nm).
• Aplicación en la espectroscopia de fluorescencia de correlación cruzada (FCCS) de un solo láser de cuatro colores.
• Utilizado en las imágenes de transferencia de energía de resonancia (FRET) de Förster con los biosensores CFP-YFP y LSSmOrange-mKate2.

Principales resultados:

• LSSmOrange exhibe un brillo comparable al verde-amarillo FPs y significativamente más alto que el rojo LSSFP.
• Se habilitó un nuevo FCCS de cuatro colores para el análisis cuantitativo de una sola molécula.
• Imágenes simultáneas facilitadas de dos pares de FRET (incluyendo CFP-YFP) utilizando una sola longitud de onda de excitación.
• Imágenes demostradas en tiempo real de la actividad apoptótica y las fluctuaciones del calcio.

Conclusiones:

• LSSmOrange llena efectivamente la brecha espectral entre los LSSFPs verde-amarillo y rojo.
• Su brillo y sus propiedades espectrales permiten nuevas aplicaciones multicolores y técnicas biofísicas avanzadas.
• Los estudios revelaron el mecanismo de transferencia de protones en estado excitado responsable del fenotipo LSS.