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Proteins are involved in several cellular processes and biochemical reactions. Analyzing a specific protein of interest requires it to be isolated from the other proteins in the cell. This is achieved by overexpressing the specific gene in a suitable host to produce large quantities of the target protein. A tag or label is recombined with the gene to produce a fusion protein containing the target protein and the tag. The tags on these fusion proteins can then be used for easy detection and...

Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

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Total internal reflection fluorescence microscopy or TIRF is an advanced microscopic technique used to visualize fluorophores in samples close to a solid surface with a higher refractive index, such as a glass coverslip. TIRF only allows fluorophores in proximity to the solid surface to be excited. When light from a medium with a lower refractive index (such as air) hits the glass coverslip at a critical angle, the light undergoes total internal reflection stead of passing through the glass.

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DNA probes are fragments of DNA labeled with a reporter tag to enable their detection or purification. The resulting labeled DNA probes can then hybridize to target nucleic acid sequences through complementary base-pairing, and may be used to recover or identify these regions.
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Etiqueta TMP covalente de segunda generación para imágenes de células vivas.

Zhixing Chen¹, Chaoran Jing, Sarah S Gallagher

¹Department of Chemistry, Columbia University, New York, New York 10027, USA.

Journal of the American Chemical Society

|August 10, 2012

Resumen

Este resumen es generado por máquina.

Una nueva y mejorada etiqueta TMP permite un etiquetado covalente más rápido de proteínas intracelulares en células vivas utilizando fluoroforos orgánicos avanzados. Este avance mejora las técnicas de etiquetado de proteínas para la investigación biológica y las aplicaciones de biología sintética.

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Área de la Ciencia:

La bioquímica es la bioquímica.
Biología Química Biología química.
Biología sintética Biología sintética.

Sus antecedentes:

Los fluoróforos orgánicos ofrecen ventajas sobre las proteínas fluorescentes para el etiquetado celular.
Los diseños anteriores de etiquetas TMP tenían limitaciones en la velocidad y eficiencia de etiquetado en células vivas.

Objetivo del estudio:

Desarrollar una etiqueta TMP covalente de segunda generación con cinética de etiquetado mejorada.
Para permitir el etiquetado eficiente de diversas proteínas intracelulares en las células vivas.

Principales métodos:

Diseñado un acrilamida-trimetoprim-fluoroforo (A-TMP-fluoroforo v2.0) con un enlazador optimizado.
Utilizó un nucleófilo de cisteína (Cys) diseñado cerca del bolsillo de unión de la dihidrofolato reductasa (eDHFR) de Escherichia coli.
Se examinaron las variantes eDHFR:Cys para identificar los pares óptimos de etiquetas-nucleófilos para un rápido etiquetado covalente.

Principales resultados:

Se identificó la variante eDHFR:L28C con una vida media de etiquetado de 8 minutos in vitro.
Se ha demostrado el éxito de la obtención de imágenes de células vivas de varios objetivos de proteínas utilizando sondas A-TMP-fluoróforo v2.0.
Desarrolló una síntesis química eficiente para la producción de etiquetas A-TMP-probe v2.0.

Conclusiones:

La etiqueta TMP covalente de segunda generación proporciona un método robusto y eficiente para el etiquetado de proteínas intracelulares en células vivas.
La reactividad inducida por proximidad y la química orgánica son herramientas poderosas para la ingeniería de etiquetas químicas y el avance de la biología sintética.