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Updated: May 17, 2026
07:56
Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One α-Synuclein Monomer at a Time
Published on: May 30, 2021
Dos pirenilalaninas en la dihidrofolato reductasa forman un excimero que permite el estudio de la dinámica de las
Shengxi Chen1, Lin Wang, Nour Eddine Fahmi
1Center for BioEnergetics, Biodesign Institute, and Department of Chemistry and Biochemistry, Arizona State University, Tempe, Arizona 85287, USA.
Journal of the American Chemical Society
|November 3, 2012
Resumen
Los investigadores diseñaron la dihidrofolato reductasa (DHFR) con grupos de pireno para observar la formación del excímero, revelando cambios en la conformación de la proteína relacionados con la liberación del producto durante las reacciones enzimáticas.
Área de la Ciencia:
- La bioquímica es la bioquímica.
- Enzimología Enzimología.
- Ingeniería de proteínas Ingeniería de proteínas.
Sus antecedentes:
- Los pares de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) carecen de sensibilidad a los cambios de pequeña distancia en las enzimas.
- Las dimensiones de la dihidrofolato reductasa (DHFR) limitan la utilidad de los enfoques FRET tradicionales.
Objetivo del estudio:
- Desarrollar un método más sensible para observar los cambios conformacionales de las enzimas.
- Para investigar la dinámica de las proteínas en DHFR utilizando la formación de excímero de pireno.
Principales métodos:
- DHFR de ingeniería mediante la introducción de dos fracciones de pireno en las posiciones 16 y 49 utilizando un sistema de expresión in vitro.
- Utilizado pireno-1-ilalanil-tRNA (CUA) para la incorporación específica del sitio de pireno.
- Formación de excímero observada (λ(ex) 342 nm; λ(em) 481 nm) en DHFR modificado bajo condiciones de rotación única y múltiple.
Principales resultados:
- Se generó con éxito un DHFR modificado capaz de la formación de excimer.
- El DHFR modificado mantuvo su actividad catalítica.
- Se observó la formación de excimer correlacionada con cambios de conformación de la proteína después de la transferencia de hidrógeno.
Conclusiones:
- La formación del excímero pireno proporciona una lectura sensible para la dinámica conformacional del DHFR.
- Es probable que los cambios conformacionales observados estén asociados con el ciclo catalítico de la enzima, específicamente la disociación del producto.
