El cribado microfluídico de los desplazamientos de movilidad electroforética aclara la función de unión del...

Área de la Ciencia:

• Biología Molecular Biología Molecular
• La biofísica es la biofísica.
• La bioquímica es la bioquímica.

Sus antecedentes:

• Los riboswitches son sensores de ARN que regulan la expresión génica al alterar la conformación al unirse a metabolitos de moléculas pequeñas.
• Los métodos existentes para estudiar las interacciones riboswitch-ligando a menudo consumen mucho tiempo y carecen de capacidades de alto rendimiento.
• Existe la necesidad de una herramienta rápida y cuantitativa para examinar los riboswitches y su unión a los ligandos.

Objetivo del estudio:

• Introducir y validar un ensayo de desplazamiento de movilidad microfluídica para alto rendimiento, análisis cuantitativo de la unión riboswitch-ligando.
• Demostrar la capacidad del ensayo para examinar y validar rápidamente los riboswitches candidatos.
• Establecer una plataforma escalable para la caracterización de los cambios conformacionales de los riboswitches y la cinética de unión.

Principales métodos:

• Desarrollo de un ensayo de desplazamiento de movilidad microfluídica para la cuantificación precisa de la unión riboswitch-ligando.
• Cribado y validación de cinco riboswitches SAM-I candidatos de bacterias termofílicas y criófilas.
• Cuantificación de las constantes de disociación de equilibrio (K(d)) utilizando el ensayo microfluídico y la comparación con los resultados de sondas en línea.

Principales resultados:

• Las pantallas de ensayo microfluídico cambian de ribos en un 0,3% del tiempo requerido para los ensayos de banco tradicionales (3,2 minutos frente a 1020 minutos).
• El ensayo proporciona una mayor resolución, cuantificación y repetibilidad para detectar pequeños cambios de movilidad y cambios conformacionales.
• Las constantes de disociación de equilibrio (K(d)) se cuantificaron con precisión tanto para los riboswitches SAM-I conocidos como para los candidatos.

Conclusiones:

• El ensayo de desplazamiento de movilidad microfluídica es una herramienta rápida, sensible y escalable para estudiar las interacciones riboswitch-ligando.
• Esta tecnología acelera el descubrimiento y la selección de nuevos riboswitches.
• El ensayo facilita el desarrollo de nuevos antibióticos dirigidos a los riboswitches bacterianos.