Superar la fluorescencia del compuesto en el ensayo de cribado FLiK con fluoróforos con desplazamiento al rojo

Área de la Ciencia:

• La bioquímica es la bioquímica.
• Pruebas de Enzimas de Enzima.
• Espectroscopia de fluorescencia Espectroscopia de fluorescencia Espectroscopia de fluorescencia Espectroscopia de fluorescencia Espectroscopia de fluorescencia Espectroscopia de fluorescencia Espectroscopia de fluorescencia Espectroscopia de fluorescencia Espectroscopia de fluorescencia

Sus antecedentes:

• El cribado de alto rendimiento (HTS) para nuevos moduladores enzimáticos, particularmente las quinasas, es crucial para el descubrimiento de fármacos.
• Los ensayos tradicionales basados en fluorescencia pueden sufrir falsos positivos / negativos debido a la fluorescencia intrínseca del compuesto.
• El ensayo de etiquetas fluorescentes en kinasas (FLiK) desarrollado anteriormente mide los cambios conformacionales de la kinasa, pero es susceptible a la interferencia de los compuestos fluorescentes.

Objetivo del estudio:

• Para optimizar el ensayo FLiK para mitigar la interferencia de la fluorescencia intrínseca del compuesto.
• Para permitir la detección confiable de cambios conformacionales inducidos por ligandos en las quinasas, incluso con compuestos altamente conjugados.
• Establecer un método de detección robusto basado en la fluorescencia para las interacciones de la kinasa-ligando.

Principales métodos:

• Modificación del ensayo FLiK mediante la identificación y utilización de nuevos fluoróforos con excitación en el espectro rojo lejano.
• Prueba del ensayo optimizado en tres construcciones de quinasas diferentes con distintos sitios de etiquetado.
• Evaluar la capacidad del ensayo para medir de manera confiable los cambios conformacionales inducidos por ligandos en presencia de compuestos potencialmente interferentes.

Principales resultados:

• El ensayo optimizado evita con éxito la interferencia de la fluorescencia intrínseca del compuesto mediante el uso de fluoróforos emisores de color rojo lejano.
• Se logró una medición confiable de los cambios conformacionales de la quinasa, incluso con compuestos rígidos y altamente conjugados.
• El método demostró robustez en diferentes construcciones de kinasa y sitios de etiquetado.

Conclusiones:

• El análisis optimizado de FLiK de color rojo lejano proporciona un método confiable para estudiar las interacciones kinasa-ligando.
• Este avance supera una limitación significativa en los ensayos bioquímicos basados en fluorescencia, mejorando la identificación de aciertos.
• El estudio ofrece una guía para el desarrollo de nuevos ensayos de detección basados en fluorescencia para diversos objetivos biológicos.