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Southern Blot02:57

Southern Blot

Agarose gel electrophoresis is very useful in separating DNA fragments by size. Running a DNA ladder containing fragments of the known length alongside the sample helps determine the approximate length of the sample DNA fragments. However, additional steps are needed to verify the sequence identity of the sample DNA fragments.
Denatured DNA fragments must be transferred onto a carrier membrane from the gel to make it accessible to a probe - a small ssDNA fragment complementary to the target DNA...
Labeling DNA Probes03:31

Labeling DNA Probes

DNA probes are fragments of DNA labeled with a reporter tag to enable their detection or purification. The resulting labeled DNA probes can then hybridize to target nucleic acid sequences through complementary base-pairing, and may be used to recover or identify these regions.
Radioisotopes, fluorophores, or small molecule binding partners like biotin or digoxigenin, are the most widely used reporter tags for labeling DNA probes. These labels can be attached to the probe DNA molecule via...

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Captura selectiva de ácido nucleico con sondas covalentes blindadas

Jeffrey R Vieregg1, Hosea M Nelson, Brian M Stoltz

  • 1Department of Bioengineering, California Institute of Technology, Pasadena, California 91125, USA.

Journal of the American Chemical Society
|June 11, 2013
PubMed
Resumen

Las sondas covalentes blindadas (SC) ofrecen una mayor selectividad y una captura duradera de ácido nucleico al combinar el emparejamiento de bases con el enlace cruzado covalente. Estas sondas superan las limitaciones de los métodos tradicionales, permitiendo una unión estable incluso en condiciones perturbadoras.

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Área de la Ciencia:

  • Biología Molecular Biología Molecular
  • La bioquímica es la bioquímica.
  • Química del ácido nucleico Química del ácido nucleico

Sus antecedentes:

  • Las sondas tradicionales de ácido nucleico se basan en el emparejamiento de bases, lo que lleva a limitaciones en la selectividad y la afinidad.
  • La selectividad imperfecta y la unión reversible dificultan la eficiencia y la estabilidad de las sondas convencionales.
  • Existe una compensación fundamental entre la selectividad de la sonda y la durabilidad de la captura de moléculas objetivo.

Objetivo del estudio:

  • Introducir y caracterizar las sondas Shielded Covalent (SC) que superan las limitaciones de las sondas tradicionales de ácido nucleico.
  • Demostrar la capacidad de las sondas SC para lograr una alta selectividad y una captura de objetivos duradera.
  • Explorar las aplicaciones potenciales de las sondas SC en diversos entornos biológicos.

Principales métodos:

  • Desarrollo de sondas SC utilizando emparejamiento de bases programables y cambios en la conformación molecular para la selectividad.
  • Incorporación de enlaces cruzados covalentes activables para la captura de objetivos duraderos.
  • Prueba de rendimiento de la sonda con oligonucleótidos de ADN / ARN y objetivos de ARNm de longitud completa en diversas condiciones.

Principales resultados:

  • Las sondas SC lograron una captura covalente casi cuantitativa de objetivos complementarios de ADN / ARN con una alta discriminación contra objetivos no coincidentes (2-3 órdenes de magnitud).
  • Se demostró la captura covalente selectiva para objetivos de ARNm de longitud completa, comparable a la captura de oligonucleótidos.
  • Los desajustes de un solo nucleótido fueron rechazados de manera eficiente (discriminación de 1-2 órdenes de magnitud), y los enlaces cruzados fueron reversibles.

Conclusiones:

  • Las sondas SC combinan con éxito una alta selectividad de secuencia con una retención de blanco duradera, incluso en condiciones de desnaturalización.
  • Esta nueva química de la sonda supera el compromiso tradicional entre la selectividad y la unión estable.
  • Las sondas SC ofrecen diversas aplicaciones para la detección selectiva y estable de ácido nucleico en entornos difíciles.