In vitro reconstitución y análisis de la 6-deoxyeritronolide B sintasa
Brian Lowry1, Thomas Robbins, Chih-Hisang Weng
1Department of Chemical Engineering, ‡Department of Chemistry, §School of Medicine, and ⊥Medical Science Training Program, Stanford University , Stanford, California 94305, United States.
Journal of the American Chemical Society
|October 29, 2013
Resumen
Los investigadores han reconstituido con éxito la 6-deoxyeritronolide B sintasa (DEBS) in vitro. Este avance permite estudios bioquímicos detallados y la ingeniería de líneas de ensamblaje de policetídeos.
Área de la Ciencia:
- La bioquímica es la bioquímica.
- Biología Molecular Biología Molecular
- Biología sintética Biología sintética.
Sus antecedentes:
- Las poliquetidas sintasas (PKS) son cruciales para la biosíntesis de productos naturales.
- Los esfuerzos anteriores no han logrado la reconstitución in vitro de la PKS completa, de origen natural, como la 6-deoxyeritronolido B sintasa (DEBS).
Objetivo del estudio:
- Para reconstituir la compleja hexamodular 6-deoxyeritronolide B sintasa (DEBS) in vitro a partir de componentes de proteínas purificadas. para la reconstitución de la compleja hexamodular 6-deoxyeritronolide B sintasa (DEBS) in vitro a partir de componentes de proteínas purificadas. para la reconstitución de la compleja hexamodular 6-deoxyeritronolide B sintasa (DEBS) in vitro a partir de componentes de proteínas purificadas. para la reconstitución de la compleja hexamodular 6-deoxyeritronolide B sintasa (DEBS) in vitro a partir de componentes de proteínas purificadas.
- Caracterizar cuantitativamente las propiedades enzimáticas del sistema DEBS reconstituido.
- Para explorar la especificidad del sustrato y la formación de productos del DEBS. reconstituido.
Principales métodos:
- Purificación de los componentes proteicos individuales del DEBS.
- Ensamblaje in vitro del complejo hexamodular DEBS.
- Análisis enzimáticos para determinar las tasas de rotación y análisis de productos utilizando espectrometría de masas.
- Caracterización de la utilización del sustrato (metilmalonilo-CoA y etilmalonilo-CoA).
Principales resultados:
- Reconstitución exitosa del DEBS hexamodular completo y funcional in vitro.
- Se determinó la tasa de rotación máxima del DEBS reconstituido (1.1 min-1).
- Síntesis regiospecífica observada de análogos modificados de policetida cuando se presentan con concentraciones mixtas de sustrato.
Conclusiones:
- El sistema DEBS reconstituido proporciona una poderosa plataforma para la investigación bioquímica.
- Este trabajo sienta las bases para la futura ingeniería racional de líneas de ensamblaje de policetídeos para el descubrimiento de nuevos compuestos.
