Las pantallas genéticas en células humanas utilizando el sistema CRISPR-Cas9

Área de la Ciencia:

• Genética La genética.
• Biología Molecular Biología Molecular
• La edición del genoma.

Sus antecedentes:

• El sistema CRISPR-Cas9 ha revolucionado la genética de los mamíferos.
• Las herramientas existentes permiten la rápida generación de líneas celulares y animales genéticamente modificados.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar y validar un enfoque de cribado genético agrupado y de pérdida de función utilizando una biblioteca de ARN único guía lentiviral (sgRNA) a escala genómica.
• Evaluar la utilidad de este método de cribado para la selección positiva y negativa en células de mamíferos.

Principales métodos:

• Se utilizó una biblioteca de sgRNA lentiviral a escala de genoma con 73.000 sgRNA para generar colecciones knockout en dos líneas celulares humanas.
• Se realizaron pruebas genéticas conjuntas para la resistencia a la 6-tioguanina y la etoposida, y para los genes esenciales a través de la selección negativa.
• Se empleó secuenciación masiva paralela para rastrear el complejo grupo de mutantes después de la integración estable de las cintas de expresión de sgRNA.

Principales resultados:

• Una prueba de detección de la resistencia a la 6-tioguanina identificó con éxito los componentes de la vía de reparación del desajuste del ADN.
• Una pantalla para la resistencia a los etoposidos identificó TOP2A y CDK6.
• Las pantallas de selección negativa identificaron conjuntos de genes involucrados en procesos celulares fundamentales, y la eficiencia del sgRNA estaba vinculada a motivos de secuencia específicos.

Conclusiones:

• Las pantallas Cas9/sgRNA representan un enfoque poderoso y sistemático para el análisis genético en células de mamíferos.
• El método de cribado desarrollado es eficaz tanto para las pantallas de selección positivas como negativas.
• La predicción de sgRNAs efectivos basados en motivos de secuencia puede mejorar la eficiencia del cribado.