Bases estructurales del reconocimiento de ADN objetivo dependiente de PAM por la endonucleasa Cas9

Área de la Ciencia:

• Biología Molecular Biología Molecular
• Biología Estructural Biología estructural.
• Genética La genética.

Sus antecedentes:

• La proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9) es una endonucleasa guiada por ARN esencial para la edición del genoma.
• La función de Cas9 se basa en el reconocimiento de un motivo adyacente de protospacer (PAM) en el ADN objetivo.
• Comprender la interacción del Cas9-ADN es crucial para el avance de las tecnologías de edición de genes.

Objetivo del estudio:

• Para aclarar la base estructural del Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) reconocimiento de la secuencia canónica 5'-NGG-3' PAM.
• Proporcionar un marco estructural para comprender el desenrollamiento del ADN dependiente de PAM y la formación de híbridos de ARN-ADN.
• Para sentar las bases para la ingeniería de variantes SpCas9 con especificidades PAM alteradas.

Principales métodos:

• Se empleó cristalografía de rayos X para determinar la estructura de SpCas9.9.
• El estudio utilizó un complejo de SpCas9, un ARN guía de una sola molécula, y ADN objetivo con un NGG PAM.
• El análisis estructural se centró en las interacciones entre SpCas9, el ARN guía, el ADN objetivo y la secuencia PAM.

Principales resultados:

• La estructura cristalina revela que el motivo PAM se encuentra dentro de un dúplex de ADN emparejado de bases.
• Los residuos de arginina conservados en el dominio C-terminal de Cas9 interactúan con el dinucleótido GG de la PAM a través de interacciones de ranura mayor.
• Las interacciones con el surco menor dúplex PAM y el grupo fosfodiéster +1 facilitan la separación de cadenas de ADN locales aguas arriba del PAM.

Conclusiones:

• Los hallazgos sugieren un mecanismo para la fusión de ADN dependiente de PAM y la posterior formación de híbridos de ARN-ADN durante la actividad de CRISPR-Cas9.
• Esta visión estructural proporciona una base para el diseño racional de enzimas Cas9 con especificidades PAM modificadas.
• El estudio mejora nuestra comprensión de los mecanismos moleculares fundamentales que subyacen a la edición del genoma CRISPR-Cas9.