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CRISPR01:59

CRISPR

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Genome editing technologies allow scientists to modify an organism’s DNA via the addition, removal, or rearrangement of genetic material at specific genomic locations. These types of techniques could potentially be used to cure genetic disorders such as hemophilia and sickle cell anemia. One popular and widely used DNA-editing research tool that could lead to safe and effective cures for genetic disorders is the CRISPR-Cas9 system. CRISPR-Cas9 stands for Clustered Regularly Interspaced...
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CRISPR

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CRISPR/Cas9 Genome Editing01:28

CRISPR/Cas9 Genome Editing

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The CRISPR-Cas system serves as a bacterial defense mechanism against invading genetic elements such as viruses and plasmids, forming the foundation for its adaptation as a powerful genome-editing tool. Originally discovered in prokaryotes, this system has been repurposed to revolutionize genetic engineering across a wide range of organisms, including plants, animals, and humans. The core component, Cas9, is an endonuclease derived from Streptococcus pyogenes, capable of introducing...
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CRISPR and crRNAs02:53

CRISPR and crRNAs

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Bacteria and archaea are susceptible to viral infections just like eukaryotes; therefore, they have developed a unique adaptive immune system to protect themselves. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins (CRISPR-Cas) are present in more than 45% of known bacteria and 90% of known archaea.
The CRISPR-Cas system stores a copy of foreign DNA in the host genome and uses it to identify the foreign DNA upon reinfection. CRISPR-Cas has three different...
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The Antiviral System of Bacteria and Archaea: CRISPR01:23

The Antiviral System of Bacteria and Archaea: CRISPR

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CRISPR stands for Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats is a adaptive immune system found in bacteria and archaea that protects against viral infections. This system enables prokaryotic cells to identify, remember, and neutralize foreign genetic elements, primarily bacteriophages, by storing fragments of the invader’s DNA as a genetic memory.The CRISPR immune response begins during an initial infection. Cas (CRISPR-associated) proteins play a central role in this...
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Homologous Recombination02:31

Homologous Recombination

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The basic reaction of homologous recombination (HR) involves two chromatids that contain DNA sequences sharing a significant stretch of identity. One of these sequences uses a strand from another as a template to synthesize DNA in an enzyme-catalyzed reaction. The final product is a novel amalgamation of the two substrates. To ensure an accurate recombination of sequences, HR is restricted to the S and G2 phases of the cell cycle. At these stages, the DNA has been replicated already and the...
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Reconocimiento y escisión de ARN programable mediante CRISPR/Cas9

Mitchell R O'Connell1, Benjamin L Oakes1, Samuel H Sternberg2

  • 1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, California 94720, USA.

Nature
|October 3, 2014
PubMed
Resumen

CRISPR-Cas9 ahora puede dirigirse al ARN, no solo al ADN. Mediante el uso de una secuencia de ADN separada (PAMmer), Cas9 puede unirse y cortar moléculas específicas de ARN, lo que permite el reconocimiento programable de transcripciones.

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Área de la Ciencia:

  • Biología Molecular Biología Molecular
  • Genética La genética.
  • Biotecnología La biotecnología es la biotecnología.

Sus antecedentes:

  • La proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9) es una endonucleasa de ADN que guía el reconocimiento del objetivo a través de la complementariedad del ARN y un motivo adyacente de protospacer (PAM).
  • Cas9 es ampliamente utilizado para la ingeniería genómica, pero se consideró incapaz de dirigirse al ARN.
  • Comprender la especificidad del sustrato de Cas9 es crucial para expandir sus aplicaciones.

Objetivo del estudio:

  • Para investigar si Cas9 puede dirigirse a ARN de una sola cadena (ARNss) con la ayuda de una secuencia PAM.
  • Para explorar el mecanismo de la interacción y escisión del Cas9-ARN.
  • Para demostrar la utilidad de Cas9 para la orientación de ARN en un contexto biológico.

Principales métodos:

  • En ensayos in vitro se utilizan el Cas9, el ARN guía, las dianas del ARNss y los oligonucleótidos PAM transpresentados (PAMmers).
  • Caracterización de la afinidad de unión de Cas9 a los objetivos de ssRNA con PAMmers.
  • Demostración de la escisión del ssRNA específico del sitio estimulada por los PAMmers.
  • Aplicación del método para aislar el ARN mensajero endógeno (ARNm) de las células.

Principales resultados:

  • Cas9 se une con alta afinidad a los objetivos de ssRNA cuando se proporciona una secuencia PAM en trans a través de un oligonucleótido de ADN (PAMmer).
  • Los PAMmers estimulan la escisión endonucleolítica Cas9-mediada y específica del sitio de los objetivos de ssRNA.
  • Cas9 puede ser dirigido a los objetivos de ARN, evitando las secuencias de ADN utilizando PAMmers específicamente diseñados.
  • Esta estrategia permitió con éxito el aislamiento de un ARNm endógeno específico de las células.

Conclusiones:

  • La unión PAM de Cas9 está fundamentalmente vinculada a su selección de sustrato, lo que permite la orientación del ARN.
  • Cas9 se puede programar para el reconocimiento de transcripciones específicas y la escisión sin necesidad de etiquetas de destino.
  • Este trabajo expande la utilidad de Cas9 más allá del ADN, abriendo nuevas vías para la manipulación y el análisis del ARN.