Optimización y expansión de una transaminación mediada por N-metilpiridinium-4-carboxaldehído selectiva del sitio...

Área de la Ciencia:

• Biología Química Biología química.
• Ingeniería de proteínas Ingeniería de proteínas.
• Bioconjugación Química de la bioconjugación

Sus antecedentes:

• La bioconjugación selectiva del sitio permite la unión química de grupos funcionales a las proteínas, lo que permite el estudio de la función de las proteínas y el desarrollo de materiales basados en proteínas.
• Trabajos anteriores establecieron N-metilpiridinium-4-carboxaldehído benzenosulfonato (sal de Rapoport, RS) para la transaminación N-terminal, creando un aldehído reactivo o un mango cetónico para la modificación.
• La expresión de proteínas recombinantes en E. coli a menudo da como resultado una metionina N-terminal que impide la transaminación mediada por RS de las proteínas glutamato-terminales.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar estrategias para superar los desafíos en la modificación N-terminal de las proteínas recombinantes expresadas en E. coli.
• Para permitir la bioconjugación selectiva del sitio de proteínas con secuencias N-terminales deseables para una mayor funcionalidad.
• Para validar la aplicabilidad de la transaminación RS en secuencias N-terminales modificadas y nativas en una enzima modelo.

Principales métodos:

• Inserción de un sitio de escisión proteolítica del Factor Xa para generar un residuo de glutamato N-terminal.
• Expresión y caracterización de proteínas con secuencias N-terminales alternativas de alto rendimiento.
• Mutagénesis dirigida al sitio de una enzima modelo de celulosa (endoglucanasa de Pyrococcus horikoshii).
• Transaminación RS seguida de una modificación con reactivos de alkoxiamina.

Principales resultados:

• Generación exitosa de residuos de glutamato N-terminal a través de la escisión del Factor Xa, facilitando la transaminación RS.
• Identificación de secuencias N-terminales alternativas susceptibles a la transaminación directa de RS.
• Demostración de que la transaminación RS y la posterior modificación de la alkoxiamina no impiden la actividad celulótica de la enzima modelo.
• Validación de estas estrategias en una endoglucanasa termofílica.

Conclusiones:

• Los métodos desarrollados superan las limitaciones en la expresión de secuencias N-terminales adecuadas para la modificación de proteínas mediadas por RS en E. coli.
• La funcionalización del N-terminal selectivo del sitio es alcanzable y compatible con la función de la proteína, como lo demuestra la actividad de la celulasa no modificada.
• Este trabajo amplía la utilidad de la transaminación RS para crear bioconjugados de proteínas bien definidos para diversas aplicaciones.