Sensor de plegado de fluorescencia para monitorear el estrés proteico en células vivas

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Biología celular
• Biología molecular

Sus antecedentes:

• La homeostasis de las proteínas celulares (proteostasis) se ve afectada por el mal plegamiento y la agregación bajo estrés.
• Cuantificar la capacidad de la red de proteostasis en tiempo real es crucial para comprender las respuestas de estrés celular.
• Los métodos existentes carecen de mediciones dinámicas en tiempo real de la capacidad de proteostasis.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un nuevo sensor de plegamiento de proteínas bioortogonal para la cuantificación en tiempo real de la capacidad de la red de proteostasis celular.
• Para utilizar una enzima de retroaldoasa (RA) diseñada de nuevo como un sensor plegable.
• Establecer paradigmas experimentales para medir la dinámica de la proteostasis utilizando una sonda fluorescente regulada por moléculas pequeñas.

Principales métodos:

• Diseñado un mutante termo-lábil de un nuevo diseño de la enzima retroaldoasa (RA).
• Desarrolló una pequeña molécula fluorogénica que se vuelve fluorescente al unirse y reaccionar con AR plegada.
• Implementó dos paradigmas experimentales: correlación de fluorescencia directa y análisis de seguimiento de pulso de la agregación de proteínas.

Principales resultados:

• Se demostró que la fluorescencia conjugada de moléculas pequeñas de AR se correlaciona con los niveles de AR plegada, lo que refleja la capacidad de proteostasis.
• Se ha demostrado la formación de agregados del conjugado de la sonda AR-fluorogénica en condiciones que dificultan la proteostasis.
• Se observó un replegamiento y degradación inducidos por el estrés del conjugado de la sonda AR-fluorogénica, lo que indica una proteostasis dinámica.

Conclusiones:

• El sensor fluorescente basado en AR desarrollado proporciona una herramienta sensible para la evaluación en tiempo real de la capacidad de la red de proteostasis celular.
• Esta sonda permite el monitoreo dinámico del plegamiento de proteínas, la agregación y las respuestas de estrés celular.
• Los hallazgos ofrecen nuevos conocimientos sobre la resiliencia celular y los mecanismos subyacentes al mantenimiento de la proteostasis.