La transferencia inversa de electrones completa el ciclo catalítico en una reductasa ribonucleótida sustituida por...

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Enzimología
• La Química Radical

Sus antecedentes:

• La ribonucleotida reductasa (RNR) de la clase Ia de Escherichia coli es una enzima crucial para la síntesis de ADN, compuesta por subunidades α2 y β2.
• La enzima cataliza la producción de desoxinucleótidos (dNDP) a través de un mecanismo radical que involucra a los radicales tirosilo y tiilo a través de subunidades.
• Los estudios anteriores estaban limitados por cambios conformacionales lentos que impedían la observación de radicales intermedios.

Objetivo del estudio:

• Investigar la vía de propagación de los radicales y el mecanismo catalítico de la E. coli clase Ia RNR.
• Para superar las limitaciones en la observación de radicales intermedios transitorios mediante el uso de una subunidad β2 modificada.

Principales métodos:

• Inserción específica del sitio de 2,3,5-trifluorotirosina en la posición 122 de la subunidad β2 (F3Y(•) -β2 para perturbar la conformación.
• Espectroscopia de resonancia paramagnética de electrones de congelación rápida (EPR) y análisis de extinción química rápida.
• Análisis cinético de la reacción F3Y(•) -β2, α2, CDP y ATP.

Principales resultados:

• El mutante F3Y() -β2 mantuvo la actividad catalítica, lo que permitió la observación de los radicales intermedios.
• La generación de Y356 y dCDP se observó a 30 s-1, lo que indica una propagación radical eficiente.
• Se identificó la reoxidación de F3Y que limita la velocidad, y se demostró que el radical Y122 se reduce y reoxida por volumen de negocios.

Conclusiones:

• El estudio demuestra un mecanismo en el que el radical Y122 en β2 se reduce y se reoxida durante cada ciclo catalítico.
• Proporciona la primera evidencia directa de un radical de la vía que completa el ciclo catalítico en un complejo α2β2 activo.
• Elucida el papel de la conformación proteica y de los radicales intermedios en la función RNR de E. coli.