Cambios conformacionales inducidos por ligandos de un transportador de membrana en células de E. coli observados con...

Área de la Ciencia:

• Biología estructural
• La biofísica
• Investigación de las proteínas de membrana

Sus antecedentes:

• Determinar las estructuras de alta resolución y los cambios conformacionales de las proteínas de membrana dentro de su entorno celular sigue siendo un desafío.
• La doble resonancia pulsada electrón-electrón (PELDOR) es eficaz para el monitoreo de cambios conformacionales en complejos de proteínas de membrana purificadas.
• Los métodos actuales a menudo requieren extracción, purificación y reconstitución de detergentes, lo que puede alterar la estructura y la función de las proteínas.

Objetivo del estudio:

• Demostrar la viabilidad del uso de PELDOR para observar cambios conformacionales en las proteínas de la membrana dentro de las células intactas.
• Desarrollar una estrategia de etiquetado específica para las proteínas de la membrana externa en su contexto celular nativo.
• Caracterizar los cambios conformacionales inducidos por el ligando en el transportador de cobalamina BtuB.

Principales métodos:

• Se utilizó la doble resonancia pulsada de electrones y electrones (PELDOR) en células de Escherichia coli intactas.
• Desarrolló una estrategia de etiquetado selectivo que explota la falta de cisteínas reactivas en las proteínas de la membrana externa y la reducción selectiva de las etiquetas de espín periplásmicas.
• Etiquetado específicamente con el transportador de cobalamina BtuB para monitorear los cambios conformacionales en su segundo bucle extracelular.

Principales resultados:

• PELDOR demostrado con éxito para la observación de cambios conformacionales en una proteína de membrana (BtuB) dentro de células bacterianas intactas.
• Alteraciones conformacionales inducidas por la unión de ligandos en el segundo bucle extracelular de BtuB.
• Los datos de PELDOR fueron consistentes con las estructuras cristalinas de alta resolución, validando el enfoque dentro de las células.

Conclusiones:

• Este estudio presenta la primera prueba de concepto para los estudios PELDOR en células de proteínas de membrana.
• El método desarrollado evita el tratamiento y la purificación con detergentes, preservando el entorno celular nativo.
• Este enfoque abre nuevas vías para estudiar la estructura, la función y las interacciones de las proteínas de la membrana externa a alta resolución in situ.