Estructura y ingeniería de Francisella novicida Cas9

Área de la Ciencia:

• Biología estructural
• Biología molecular
• Ingeniería genómica

Sus antecedentes:

• La enzima Cas9, guiada por el ARN, realiza la escisión de ADN de doble cadena para la edición programable del genoma.
• La actividad de Cas9 está limitada por el requisito de una secuencia específica de motivo adyacente de protospacer (PAM).
• Comprender las interacciones de Cas9-PAM es crucial para expandir sus aplicaciones de edición de genoma.

Objetivo del estudio:

• Determinar las estructuras cristalinas de alta resolución de Francisella novicida Cas9 (FnCas9) con complejos de ARN guía y ADN objetivo.
• Comparar la estructura de FnCas9 con otros ortólogos de Cas9 para identificar las características conservadas y divergentes.
• Diseñar una variante de FnCas9 con especificidad PAM alterada y demostrar su utilidad en la edición del genoma.

Principales métodos:

• Se utilizó la cristalografía de rayos X para obtener estructuras de resolución de 1,7 Å de complejos de ARN-ADN guía FnCas9.
• Se realizaron comparaciones estructurales entre FnCas9 y otros ortólogos conocidos de Cas9.
• Se empleó mutagenesis dirigida al sitio para crear variantes de FnCas9 con reconocimiento modificado de PAM.
• La microinyección de complejos de FnCas9-ribonucleoproteína en zigotos de ratón se utilizó para la edición del genoma in vivo.

Principales resultados:

• Las estructuras cristalinas revelaron características conservadas y divergentes de FnCas9 en comparación con otros ortólogos de Cas9.
• Se encontró que FnCas9 reconoce la secuencia 5'-NGG-3' PAM.
• Una variante FnCas9 fue diseñada para reconocer la secuencia PAM relajada 5'-YG-3'.
• La microinyección del FnCas9 modificado en zigotos de ratón modificó con éxito los sitios endógenos con la PAM 5'-YG-3'.

Conclusiones:

• Las ideas estructurales sobre FnCas9 proporcionan una comprensión más profunda de la diversidad del sistema CRISPR-Cas9.
• La ingeniería de FnCas9 para el reconocimiento relajado de PAM amplía significativamente el rango de sitios genómicos objetivo.
• El sistema FnCas9 modificado es prometedor para aplicaciones más amplias en la edición del genoma, incluso en sistemas de mamíferos.