Introducción eficiente de mutaciones homocigotas y heterocigotas específicas mediante el uso de CRISPR/Cas9

Área de la Ciencia:

• Biología molecular
• La genética
• Biotecnología

Sus antecedentes:

• CRISPR/Cas9 permite la edición de genes, pero la reparación dirigida por homología (HDR) para mutaciones precisas es ineficiente.
• Los métodos actuales luchan con el knock-in dirigido de mutaciones heterocigotas para el modelado de enfermedades.
• La unión de extremos no homólogos (NHEJ) a menudo introduce inserciones/eliminaciones no deseadas (indels).

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un marco de edición del genoma CRISPR/Cas9 eficiente y preciso para cambios selectivos de secuencias mono y bialélicas.
• Mejorar la eficiencia y la precisión de la reparación dirigida por homología (HDR) para modelar trastornos genéticos.
• Para permitir el golpe mutacional dirigido en alelos individuales para modelar mutaciones heterocigotas.

Principales métodos:

• Desarrolló un marco de edición del genoma CRISPR/Cas9 que incorpora mutaciones silenciosas que bloquean CRISPR/Cas.
• Estableció un método de edición del genoma sin cicatrices llamado "CORRECT".
• Se explotó la relación entre la tasa de incorporación de mutaciones y la distancia a la ruptura de doble cadena (DSB) para controlar la zigosidad.

Principales resultados:

• Se logró una introducción altamente eficiente y precisa de cambios de secuencia mono y bialélica.
• Demostró una precisión de HDR dramáticamente mayor al incorporar mutaciones de bloqueo silencioso.
• Se han generado con éxito células madre pluripotentes inducidas humanas con mutaciones heterocigotas y homocigotas de la enfermedad de Alzheimer (APP, PSEN, M146V).

Conclusiones:

• El marco desarrollado y el método CORRECT facilitan una edición genética eficiente y precisa utilizando CRISPR/Cas9.
• Este enfoque permite un control predecible de la zigosidad para un modelado preciso de la enfermedad.
• Facilita el estudio de enfermedades humanas al permitir la introducción eficiente de cambios específicos en la secuencia.