Etiquetado de proximidad directa de objetivos de proteínas de pequeñas moléculas utilizando una ligasa NEDD8 diseñada

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Biología Química
• Biología molecular

Sus antecedentes:

• La identificación de objetivos de proteínas para moléculas pequeñas bioactivas es crucial para el descubrimiento de fármacos y el desarrollo de sondas químicas.
• Los métodos existentes, como las sondas basadas en actividades y los fotoenlaces cruzados, tienen limitaciones en la identificación del objetivo.
• El etiquetado directo de proteínas que se unen a moléculas pequeñas ofrece un enfoque alternativo prometedor.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un método novedoso para el marcado de proximidad directa de proteínas que se unen a moléculas pequeñas.
• Para diseñar una ligasa promiscuo para el etiquetado covalente de pequeñas moléculas de proteínas de unión.
• Validar la eficacia del método en la identificación de los aglutinantes endógenos a las proteínas.

Principales métodos:

• Diseñado una ligasa promiscua basada en la enzima de conjugación NEDD8 (Ubc12).
• La ligasa modificada está covalentemente unida a una pequeña molécula de interés.
• Se utilizó un derivado NEDD8 biotinilado para etiquetar las lisinas superficiales en las proteínas diana.
• Se aplicó el método a las interacciones dasatinib y otras proteínas-ligando.

Principales resultados:

• Se ha demostrado la NEDDilación dirigida por dasatinib de los aglutinantes endógenos conocidos en lisatos celulares complejos.
• Mejora de la eficiencia de la NEDDilación a través de la mutagénesis racional de la ligasa modificada.
• Se aplicó con éxito la NEDDilación dirigida por afinidad a la quinasa y otras dos interacciones proteína-ligando.
• Mostró la capacidad del método para etiquetar directamente las proteínas en la unión de moléculas pequeñas.

Conclusiones:

• Desarrolló un método eficaz de etiquetado de proximidad para la identificación de objetivos de moléculas pequeñas.
• El enfoque de la ligasa y la NEDDilación proporcionan una estrategia directa y ortogonal.
• Esta técnica facilita el descubrimiento de nuevas sondas químicas y terapéuticas mediante la identificación de objetivos de proteínas.