Una plataforma de detección CRISPR de una sola célula multiplexada permite la disección sistemática de la respuesta...

Área de la Ciencia:

• La genómica
• Biología molecular
• Biología celular

Sus antecedentes:

• Los estudios de genómica funcional a menudo se enfrentan a una compensación entre el número de perturbaciones y la complejidad de los fenotipos medidos.
• Los métodos existentes limitan la escala y la resolución del análisis de perturbaciones.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar y aplicar un nuevo método, Perturb-seq, que cierre la brecha entre la detección de perturbaciones de alto rendimiento y el fenotipo detallado.
• Para diseccionar la respuesta de proteínas desplegadas de mamíferos (UPR) utilizando perturbaciones CRISPR individuales y combinatorias.

Principales métodos:

• Perturb-seq integra la secuenciación de ARN de una sola célula basada en gotas con una estrategia de codificación de barras para las perturbaciones de CRISPR, lo que permite la detección conjunta.
• Se realizaron pruebas de interferencia CRISPR a escala genómica (CRISPRi) para identificar los genes que afectan a la homeostasis de ER.
• Se aplicó la secuenciación de ARN unicelular para perfilar los efectos de numerosas perturbaciones.

Principales resultados:

• Perturb-seq permitió un agrupamiento funcional de alta precisión de los genes involucrados en el UPR.
• El análisis de una sola célula reveló la activación bifurcada de las ramas UPR dentro de las células que experimentan la misma perturbación.
• Se descubrió la activación diferencial de las ramas UPR, incluido un bucle de retroalimentación entre el translocon e IRE1α.

Conclusiones:

• Perturb-seq es una herramienta poderosa para diseccionar vías celulares complejas como el UPR a resolución de una sola célula.
• El estudio proporciona información sobre cómo los sensores de homeostasis de ER controlan las tensiones distintas.
• Los hallazgos destacan la utilidad de Perturb-seq para la genómica funcional a gran escala.