La espectroscopia de complejos de lipoxigenasa-sustrato revela la base estructural para la activación de C-H por...

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Biología Cuántica
• Enzimología

Sus antecedentes:

• La activación enzimática de C-H se basa en el túnel de hidrógeno, lo que requiere una corta distancia donante-aceptor (DAD) para una catálisis eficiente.
• La lipoxigenasa de soja (SLO) es un sistema clave para estudiar el túnel no adiabático, pero su estructura de sitio activo en el estado de tierra y el mecanismo para lograr el DAD requerido no estaban claros.
• Estudios anteriores sugirieron una disposición inusual del sitio activo o un muestreo conformacional para lograr el DAD óptimo de ~ 2,7 Å.

Objetivo del estudio:

• Esclarecer la estructura del sitio activo en estado fundamental de la lipoxigenasa de soja (SLO) y determinar cómo se logra la distancia necesaria entre el donante y el receptor de hidrógeno para el túnel no adiabático.
• Investigar si las distancias cercanas de los túneles se derivan de una geometría fija del sitio activo o de un muestreo conformacional dinámico.
• Validar las predicciones cinéticas y teóricas sobre el papel del posicionamiento del sustrato y la dinámica del sitio activo en el mecanismo catalítico del SLO.

Principales métodos:

• Utilizado Mn2+ como sustituto de la sonda de espín para el ion Fe nativo en SLO, se confirmó la fidelidad estructural a través de la difracción de rayos X.
• Se empleó la espectroscopia de doble resonancia nuclear de electrones 13C y 1H (ENDOR) para localizar con precisión los átomos del sustrato (ácido linoleico) en relación con el centro del metal.
• Sistemas de retención derivados de ENDOR integrados con simulaciones de dinámica molecular de un modelo de SLO totalmente solvado para generar una representación tridimensional del sitio activo.

Principales resultados:

• El sitio activo SLO en estado de tierra existe como una mezcla de conformadores, incluido un estado reactivo con un DAD de ~ 3.1 Å (cerca del contacto de van der Waals) y un estado inactivo con un DAD más largo.
• Esto indica que el muestreo conformacional estocástico, no una estructura de sitio activo inusual estática, es esencial para lograr el DAD corto requerido para el túnel de hidrógeno eficiente.
• El análisis de las variantes de SLO afectadas por el túnel mostró un aumento de los DAD y una alteración de la posición/rigidez del sustrato, lo que corrobora los hallazgos cinéticos y teóricos.

Conclusiones:

• La lipoxigenasa de soja logra la distancia óptima entre el donante y el receptor de hidrógeno para el túnel no adiabático a través del muestreo conformacional dinámico de su sitio activo.
• El estudio valida el poder predictivo de los tratamientos cuánticos no adiabáticos para la transferencia de electrones acoplados a protones en SLO.
• La espectroscopia ENDOR demostró ser muy sensible en las pruebas, la detección y la corroboración de las tendencias predicidas cinéticamente, revelando aspectos clave de la arquitectura y la reactividad del sitio activo de SLO.