Generación de una interfaz ortogonal proteína-proteína con un aminoácido no canónico

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Biología sintética
• Ingeniería de proteínas

Sus antecedentes:

• La chorismato mutasa de Escherichia coli (EcCM) es una enzima crucial en la vía de biosíntesis de aminoácidos aromáticos.
• Las interfaces de proteínas de ingeniería ofrecen nuevas estrategias para controlar la actividad enzimática y las funciones celulares.

Objetivo del estudio:

• Diseñar la interfaz homodímero EcCM para que dependa de un aminoácido no canónico (ncAA) para la actividad catalítica.
• Desarrollar un método para crear organismos cuyo crecimiento depende de la presencia de un ncAA específico.

Principales métodos:

• Se utilizó la mutagénesis dirigida al sitio para sustituir un aminoácido no canónico, la p-benzoilfenilalanina (pBzF), en el residuo 72 de EcCM.
• Se generó una biblioteca de variantes de EcCM con mutaciones en los residuos circundantes y se seleccionó en función del crecimiento en una cepa deficiente.
• Se empleó la cristalografía de rayos X para determinar la base estructural de la interfaz proteica diseñada.

Principales resultados:

• La sustitución de Tyr72 por pBzF dio lugar a una EcCM catalíticamente inactiva.
• Una variante EcCM seleccionada (Phe25', pBzF72, Thr76, Gly80', Tyr83') formó un homodímero estable con una actividad catalítica similar a la del tipo salvaje y una temperatura de fusión (Tm) de 53 °C.
• El análisis estructural reveló interacciones estabilizadoras de apilamiento pi-pi y enlace de hidrógeno en la interfaz de proteína diseñada.

Conclusiones:

• El estudio diseñó con éxito una interfaz de proteína EcCM dependiente de un aminoácido no canónico para su estabilidad y función.
• Esta estrategia de ingeniería de proteínas dependiente de ncAA proporciona una herramienta poderosa para crear organismos auxotróficos y avanzar en las aplicaciones de biología sintética.