Análisis biofísico masivo paralelo de complejos CRISPR-Cas en chips de secuenciación de próxima generación

Área de la Ciencia:

• Biología molecular
• La genética
• La bioquímica

Sus antecedentes:

• Los sistemas CRISPR-Cas usan crRNA para atacar el ADN extraño.
• La comprensión cuantitativa de la unión fuera del objetivo de CRISPR-Cas y la activación de la nucleasa es limitada.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un método de alto rendimiento para analizar las interacciones CRISPR-Cas proteína-ADN.
• Examinar exhaustivamente el reconocimiento del ADN por el complejo CRISPR-Cas (Cascade) tipo I-E y la nucleasa Cas3.

Principales métodos:

• Chips de secuenciación de próxima generación reutilizados para crear una plataforma de mapeo de asociaciones híbrida de chips (CHAMP).
• Se midieron interacciones simultáneas entre proteínas y aproximadamente 10^7 secuencias únicas de ADN.
• Analizó las secuencias mutadas del objetivo y el ADN genómico humano.

Principales resultados:

• Cascade reconoce un motivo adyacente de protospacer extendido (PAM).
• Cascada exhibe una periodicidad de 3 nucleótidos en el reconocimiento de ADN.
• El reclutamiento de Cas3 está regulado por la identidad PAM y los nucleótidos proximales PAM, que implican la liberación de la subunidad Cse1.

Conclusiones:

• Desarrolló un modelo para las restricciones biofísicas que rigen la unión al ADN fuera del objetivo.
• CHAMP permite un análisis cuantitativo de alto rendimiento de las interacciones proteína-ADN.
• Los hallazgos mejoran la comprensión de la especificidad de CRISPR-Cas y los posibles efectos fuera del objetivo.