Una única mutación en el sitio activo de la picromicina tioesterasa genera un catalizador de macrociclado más eficaz

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Biología sintética
• Ingeniería de enzimas

Sus antecedentes:

• La macrolactonización de análogos de productos naturales es un desafío para la biosíntesis y la síntesis.
• Se identificó un dominio de tioesterasa (TE) en el sistema de pikromicina (Pik) como un cuello de botella para el procesamiento de sustratos no naturales, evitando la formación de macrolactona epimerizada.

Objetivo del estudio:

• Para entender el cuello de botella catalítico en el dominio de la TE Pik.
• Diseñar una variante estereoselectiva de Pik TE con una mayor flexibilidad del sustrato y capacidades de procesamiento.
• Para permitir la producción de macrolactonas diastereoméricas.

Principales métodos:

• Simulaciones de dinámica molecular para analizar la acomodación y la conformación del sustrato dentro del sitio activo de Pik TE.
• La ingeniería enzimática del Pik TE mediante la introducción de la mutación S148C para crear una variante de ganancia de función (TE _S148C).
• Cálculos mecánicos cuánticos para comparar los mecanismos de reacción de tipo salvaje (TE_WT) y TE_S148C diseñados.
• Introducción de la mutación S148C en un módulo de la poliquetida sintasa (PikAIII-TE).

Principales resultados:

• Las simulaciones de dinámica molecular revelaron que si bien el hexaketida epimerizado estaba acomodado, las conformaciones del sustrato eran predominantemente improductivas, lo que llevaba a la hidrólisis.
• La variante TE_S148C modificada mostró una mejora en la cinética de la reacción y en el procesamiento de la ganancia de función de la hexaketida epimerizada no natural.
• El análisis mecánico cuántico indicó un cambio mecanicista en TE_S148C de adición-eliminación gradual a una sustitución de acilo concertada de menor energía en comparación con TE_WT.
• El módulo de poliquetida sintasa mutado permitió la producción de macrolactonas diastereoméricas.

Conclusiones:

• La variante TE_S148C de ingeniería supera el cuello de botella catalítico al alterar el mecanismo de reacción, lo que permite un procesamiento eficiente de sustratos no naturales.
• El estudio demuestra una estrategia exitosa para diseñar la especificidad y la flexibilidad de las enzimas en la biosíntesis de productos naturales.
• Este trabajo proporciona una base para la producción de nuevos análogos de macrolactona con posibles aplicaciones terapéuticas.