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Labeling DNA Probes03:31

Labeling DNA Probes

9.5K
DNA probes are fragments of DNA labeled with a reporter tag to enable their detection or purification. The resulting labeled DNA probes can then hybridize to target nucleic acid sequences through complementary base-pairing, and may be used to recover or identify these regions.
Radioisotopes, fluorophores, or small molecule binding partners like biotin or digoxigenin, are the most widely used reporter tags for labeling DNA probes. These labels can be attached to the probe DNA molecule via...
9.5K
Reporter Genes02:11

Reporter Genes

13.5K
Reporter genes are a type of protein-coding gene that are often tagged to a gene of interest. Once inside a target cell, reporter genes usually produce visually identifiable characteristics like fluorescence and luminescence when expressed along with the gene of interest. Thus, reporter genes “report” the presence or absence of genes of interest in an organism, determine the gene expression pattern, or track the physical location of a DNA segment or protein in the cell.
13.5K
Protein Dynamics in Living Cells01:19

Protein Dynamics in Living Cells

2.8K
Different fluorescence-based techniques are used to study the protein dynamics in living cells. These techniques include FRAP, FRET, and PET.
Fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) is a fluorescent-protein-based detection technique used to quantify protein movement rates within the cell. This method exposes a small portion of the cell to an intense laser beam. The laser beam causes permanent photobleaching of the fluorophore-tagged proteins in the exposed region. As the bleached...
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Sonda fluorescente genéticamente codificada para la detección de sirtuinas en células vivas

Weimin Xuan1, Anzhi Yao1, Peter G Schultz1

  • 1Department of Chemistry and Skaggs Institute for Chemical Biology, the Scripps Research Institute , 10550 N Torrey Pines Road, La Jolla, California 92037, United States.

Journal of the American Chemical Society
|September 1, 2017
PubMed
Resumen

Los investigadores desarrollaron una nueva sonda fluorescente para detectar la actividad de la sirtuina en las células vivas. Esta herramienta permite el monitoreo de las enzimas sirtuinas, cruciales para varios procesos biológicos.

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Área de la Ciencia:

  • La bioquímica
  • Biología molecular
  • Biología celular

Sus antecedentes:

  • Las sirtuinas son desacetilasas de proteínas dependientes de NAD+ que regulan diversas funciones biológicas.
  • Comprender la actividad de la sirtuina es crucial para descifrar los procesos celulares y los mecanismos de la enfermedad.

Objetivo del estudio:

  • Desarrollar una nueva sonda fluorescente genéticamente codificada para el monitoreo en tiempo real de la actividad de la sirtuina en las células vivas.
  • Validar la respuesta de la sonda a varias isoformas de sirtuina humana y su aplicabilidad a diferentes modificaciones posteriores a la traducción.

Principales métodos:

  • Diseño y síntesis de una sonda fluorescente genéticamente codificada (EGFP-K85AcK) que explota un residuo de lisina en el EGFP.
  • Actividad de la sonda en las células ΔcobB y HEK293T de Escherichia coli que expresan sirtuinas humanas.
  • Utilizando la fusión mCherry de la sonda para monitorear la actividad de SIRT1 y SIRT2.

Principales resultados:

  • La sonda EGFP-K85AcK respondió con éxito a múltiples sirtuinas humanas (SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT5).
  • Se realizó un seguimiento directo de la actividad de SIRT1 y SIRT2 en las células HEK293T.
  • El enfoque se extendió a otras proteínas fluorescentes y se demostró la actividad de la sirtuina en modificaciones adicionales de lisina.

Conclusiones:

  • Una nueva sonda fluorescente permite la detección sensible y específica de la actividad de la sirtuina in vivo.
  • Esta herramienta facilita el estudio de la actividad enzimática de la sirtuina y su papel en la regulación celular.
  • La plataforma de sonda puede adaptarse a diversos esfuerzos de investigación y descubrimiento de fármacos relacionados con la sirtuína.