JoVE - Journal of Visualized Experiments
JoVE Visualize
Contact Us
Esta página ha sido traducida por una máquina. Otras páginas pueden seguir apareciendo en inglés. View in English

Cinética de la búsqueda de dianas en Escherichia coli

  • 0Department of Cell and Molecular Biology, Science for Life Laboratory, Uppsala University, Uppsala, Sweden.
Clinical Neuroscience (new York, N.y.) +

|

1 de octubre de 2017

|

1 de octubre de 2017

Ver abstracta en PubMed

Resumen

Este resumen es generado por máquina.

Se necesita una sola proteína Cas9 seis horas para encontrar su secuencia de ADN objetivo en E. coli. Las altas concentraciones de Cas9 y ARN guía son necesarias para la orientación rápida del ADN.

Área De La Ciencia

  • Biología molecular
  • La genética
  • Microbiología

Sus Antecedentes

  • La proteína Cas9, guiada por el ARN, puede dirigirse a secuencias específicas de ADN.
  • Este proceso requiere el desenrollamiento del ADN para verificar el emparejamiento de bases.
  • Comprender la velocidad de esta búsqueda es crucial para las aplicaciones de edición de genes.

Objetivo Del Estudio

  • Para determinar el tiempo que le toma a la proteína Cas9 localizar una secuencia específica de ADN cromosómico dentro de una célula viva.
  • Investigar los mecanismos de búsqueda intracelular del Cas9 catalíticamente inactivo (dCas9).

Principales Métodos

  • Se utilizó la microscopía de fluorescencia de una sola molécula.
  • Ensayos de restricción y protección empleados.
  • Se estudió dCas9 en Escherichia coli vivo.

Principales Resultados

  • Una sola proteína dCas9 con etiqueta fluorescente requiere 6 horas para encontrar su secuencia de ADN objetivo.
  • Cada secuencia de ADN objetivo potencial está unida por menos de 30 milisegundos.
  • Una vez unido, dCas9 permanece asociado con el ADN hasta la replicación.
  • Las altas concentraciones tanto de Cas9 como de ARN guía son esenciales para la orientación rápida.

Conclusiones

  • La búsqueda intracelular de secuencias específicas de ADN por Cas9 es un proceso lento.
  • La orientación eficiente y rápida del ADN por Cas9 requiere altas concentraciones intracelulares tanto de la proteína como de su ARN guía.