Conocimientos funcionales revelados por el mecanismo cinético de CRISPR/Cas9

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Biología molecular
• La genética

Sus antecedentes:

• La inmunidad adaptativa de los procariotas condujo al uso generalizado de CRISPR-Cas9 para la ingeniería genética.
• El mecanismo cinético y los detalles de la escisión del ADN de Cas9 no se comprenden bien.

Objetivo del estudio:

• Establecer el mecanismo cinético de Streptococcus pyogenes Cas9 desde la unión del ARN guía a la escisión del ADN y la liberación del producto.
• Para aclarar la base cinética de la regulación de la actividad de la nucleasa HNH y RuvC dentro de Cas9.

Principales métodos:

• Análisis cinético de Streptococcus pyogenes Cas9.
• Medición simultánea de las contribuciones de la nucleasa HNH y RuvC a la escisión del ADN.

Principales resultados:

• La asociación de ADN limita la velocidad en la primera rotación; la escisión de un complejo ternario es rápida.
• La liberación extremadamente lenta del producto de ADN limita la actividad de Cas9 a un solo giro.
• El dominio HNH regula conformacionalmente la actividad de la nucleasa RuvC.

Conclusiones:

• Proporciona detalles cinéticos y funcionales cruciales de Cas9.
• Informa sobre los experimentos de edición de genes y la investigación de la escisión del ADN fuera del objetivo.
• Ayudas al desarrollo continuo de Cas9 como herramienta biotecnológica.