El enlace al objetivo de CRISPR-Cas12a desencadena una actividad indiscriminada de DNase de un solo hilo

Área de la Ciencia:

• Biología molecular
• La bioquímica
• La genética

Sus antecedentes:

• Las proteínas CRISPR-Cas12a (Cpf1) son enzimas guiadas por ARN que son parte integral de la inmunidad adaptativa bacteriana.
• Cas12a, similar a Cas9, se utiliza para la escisión dirigida del ADN en aplicaciones de edición del genoma.

Objetivo del estudio:

• Investigar las actividades de escisión del ADN de CRISPR-Cas12a más allá de las rupturas de doble cadena específicas.
• Explorar el potencial de la actividad de escisión de ssDNA de Cas12a para nuevos métodos de detección.

Principales métodos:

• Caracterización de las actividades de unión al ADN guiadas por ARN de CRISPR-Cas12a y su posterior escisión.
• Desarrollo del ensayo CRISPR trans reporter dirigido a la endonucleasa de ADN (DETECTR) mediante la combinación de la activación de la Cas12a ssDNase con la amplificación isotérmica.
• Aplicación de DETECTR para la detección del virus del papiloma humano (VPH) en muestras clínicas.

Principales resultados:

• La unión al ADN guiada por ARN por Cas12a activa una función de escisión indiscriminada de ADN de una sola hebra (ssDNA), degradando las moléculas de ssDNA.
• Esta actividad de ssDNase no específica activada por el objetivo es una propiedad conservada entre las enzimas CRISPR-Cas12 de tipo V.
• El método DETECTR demostró sensibilidad atomolar para la detección de ADN.
• DETECTR permitió la detección rápida y específica del virus del papiloma humano en muestras de pacientes.

Conclusiones:

• CRISPR-Cas12a exhibe una actividad de escisión de ssDNA no reconocida anteriormente al reconocer el objetivo.
• Esta actividad de ssDNase puede aprovecharse para desarrollar herramientas de diagnóstico altamente sensibles como DETECTR.
• DETECTR presenta una plataforma prometedora para el diagnóstico molecular, ejemplificada por la detección del VPH.