Variantes evolucionadas de Cas9 con amplia compatibilidad PAM y alta especificidad de ADN

Área de la Ciencia:

• Biología molecular
• La genética
• Biotecnología

Sus antecedentes:

• La edición del genoma CRISPR-Cas9 se basa en el reconocimiento de secuencias específicas de ADN llamadas motivos adyacentes de protospacer (PAM).
• El ampliamente utilizado Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) está limitado a las secuencias NGG PAM.
• Las variantes existentes de Cas9 ofrecen una flexibilidad PAM limitada para aplicaciones con células de mamíferos.

Objetivo del estudio:

• Para diseñar una variante Cas9 con un perfil de reconocimiento PAM ampliado.
• Evaluar la funcionalidad y la especificidad de la variante modificada en células humanas.
• Ampliar el alcance de la tecnología CRISPR-Cas9.

Principales métodos:

• Se empleó la evolución continua asistida por fagos (PACE) para desarrollar una variante expandida de PAM SpCas9 (xCas9).
• Las evaluaciones funcionales incluyeron activación transcripcional dirigida, alteración genética y edición de bases en células humanas.
• Se evaluó la actividad fuera del objetivo en todo el genoma para determinar la especificidad del ADN.

Principales resultados:

• La variante xCas9 evolucionada reconoce una amplia gama de secuencias PAM, incluidas NG, GAA y GAT.
• xCas9 demuestra la compatibilidad PAM más amplia reportada para las proteínas Cas9 activas en células de mamíferos.
• xCas9 exhibe una especificidad de ADN significativamente mayor y una menor actividad fuera del objetivo en comparación con SpCas9.

Conclusiones:

• El xCas9 diseñado expande las capacidades de orientación de ADN de los sistemas CRISPR.
• Esta variante admite diversas aplicaciones de CRISPR en células humanas con mayor precisión.
• La compatibilidad ampliada de PAM no requiere una compensación con la eficiencia de edición de Cas9 o la especificidad del ADN.