Efectos electrónicos dominantes en las reacciones biocatalíticas de Baeyer-Villiger por evolución dirigida

Área de la Ciencia:

• Química orgánica
• Biocatálisis
• Ingeniería de proteínas

Sus antecedentes:

• El control de la regioselectividad en las reacciones de Baeyer-Villiger (BV) es un desafío persistente en la química orgánica.
• Las monooxigenasas de Baeyer-Villiger (BVMOs) son enzimas capaces de catalizar las reacciones de BV, pero su regioselectividad puede ser difícil de controlar.
• Los reactivos sintéticos como el m-CPBA ofrecen un control limitado sobre la regioselectividad, a menudo favoreciendo solo el producto normal.

Objetivo del estudio:

• Para abordar el desafío de cambiar la regioselectividad BVMO normal a anormal utilizando la evolución dirigida.
• Diseñar un BVMO termostable (TmCHMO) para revertir la regioselectividad en la reacción de cetonas lineales.
• Investigar la base mecanicista del cambio de regioselectividad observado.

Principales métodos:

• Se aplicó la mutagénesis por saturación iterativa a un BVMO térmicamente estable (TmCHMO) de *Thermocrispum municipal* DSM 44069.
• La evolución dirigida se realizó utilizando 4-fenil-2-butanona como sustrato para seleccionar mutantes con regioselectividad alterada.
• Se utilizaron parámetros cinéticos, temperaturas de fusión, QM / MM y simulaciones de MD para analizar la actividad, la estabilidad y los mecanismos de reacción de las enzimas.

Principales resultados:

• La evolución dirigida invirtió la regioselectividad de TmCHMO de 99:1 (producto normal) a 2:98 (producto anormal) para la 4-fenil-2-butanona, una hazaña que no se puede lograr con m-CPBA.
• También se observó una reversión de la regioselectividad para otras dos cetonas lineales.
• Los mutantes generalmente conservan la actividad catalítica y la termostabilidad, lo que indica una ingeniería proteica exitosa.
• Las simulaciones computacionales revelaron que las mutaciones alteraban la conformación de los estados intermedios y de transición, lo que llevaba a un control conformacional que anulaba el control electrónico de la regioselectividad.

Conclusiones:

• La evolución dirigida es una herramienta poderosa para reprogramar la regioselectividad de BVMO, lo que permite la síntesis de productos BV anormales.
• Los mutantes diseñados demuestran un mecanismo de control conformacional que dicta la regioselectividad, anulando las preferencias electrónicas inherentes.
• Estos hallazgos proporcionan una base para futuros esfuerzos de ingeniería de proteínas para diseñar BVMOs con regioselectividad adaptada para diversas aplicaciones sintéticas.