Expandir el rango dinámico de los ensayos de fluorescencia a través del conteo de moléculas individuales y la...

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Química analítica
• Biotecnología

Sus antecedentes:

• Los ensayos tradicionales de fluorescencia tienen un rango dinámico (1000 veces) y una sensibilidad (subnanomolécula) limitados.
• Las moléculas biológicas exhiben grandes variaciones de abundancia (1.000.000 veces) hasta los niveles femtomolares.
• Los métodos existentes luchan por cuantificar con precisión los analíticos en rangos de concentración tan amplios.

Objetivo del estudio:

• Ampliar el rango dinámico y la sensibilidad de los ensayos basados en fluorescencia.
• Desarrollar un método que combine el conteo molecular con la calibración de moléculas individuales para las intensidades de conjunto.
• Para superar las limitaciones de los ensayos actuales de captura de superficie para la detección de analíticos de baja abundancia.

Principales métodos:

• Utilizó imágenes para combinar el conteo molecular con la calibración de una sola molécula de intensidades de conjunto.
• Se han evaluado los límites ópticos de las etiquetas fluorescentes capturadas en superficie y se han comparado las clases de fluoroforos.
• Parámetros de adquisición del detector empleados para abarcar amplios rangos de irradiación de fluorescencia.
• Se utilizó la amplificación de círculos rodantes para el etiquetado denso de biomarcadores de miRNA asociados al cáncer.

Principales resultados:

• Se identificó a la ficoeritrina como un fluoróforo superior debido al brillo intenso y homogéneo de un solo fluoróforo.
• Logró una detección y calibración precisas de una sola molécula en casi 5 órdenes de magnitud de rango de concentración.
• Se ha establecido un límite de detección de 29 femtomolares (fM) para los biomarcadores de miARN.
• Superó las limitaciones planteadas por los fluoróforos no específicos.

Conclusiones:

• Desarrollo de estrategias de imagen y conteo molecular para mejorar significativamente el rendimiento del ensayo de fluorescencia.
• Demostró un enfoque práctico para ampliar el límite de detección y el rango dinámico de los ensayos de fluorescencia superficial.
• El método muestra una amplia aplicabilidad para la detección de biomarcadores sensibles en diversas muestras biológicas.