La activación conformacional promueve la catálisis de CRISPR-Cas12a y el restablecimiento de la actividad de la...

Área de la Ciencia:

• Biología molecular
• La bioquímica
• La genética

Sus antecedentes:

• CRISPR-Cas12a (Cpf1) es una endonucleasa guiada por ARN CRISPR-Cas versátil.
• Se utiliza ampliamente en la edición del genoma por su capacidad para crear rupturas específicas de ADN de doble cadena.

Objetivo del estudio:

• Aclarar las bases estructurales y mecánicas de la activación catalítica y la actividad de escisión del ADN de Cas12a.
• Para entender el mecanismo detrás de la escisión de ADN ss colateral de Cas12a y su regulación.

Principales métodos:

• Microscopía cryoelectrónica (cryo-EM) para visualizar los intermedios de la reacción.
• Transferencia de energía de resonancia Förster de una sola molécula (smFRET) para estudiar la termodinámica y la cinética.
• Ensayos bioquímicos para evaluar la escisión del ADN y el desplazamiento del crARN.

Principales resultados:

• Se identificaron tres regiones proteicas clave involucradas en la detección del híbrido crRNA-ADN, lo que desencadena la activación de Cas12a.
• Se demostró que los cambios conformacionales conducen a la hidrólisis del enlace fosfodiéster y la escisión del ADN objetivo.
• Se reveló que Cas12a exhibe una actividad de escisión indiscriminada del ADN ss después de la activación.
• Se demostró que los nuevos crRNA pueden desplazar el bucle R, terminando la degradación colateral del ssDNA y restableciendo la especificidad.

Conclusiones:

• Propuso un modelo donde la activación conformacional impulsa la escisión indiscriminada de ssDNA.
• Se estableció que el desplazamiento del bucle R mediado por crRNA es un mecanismo para restablecer la especificidad de Cas12a.
• Proporcionó información sobre la regulación de la actividad de Cas12a para aplicaciones precisas de edición del genoma.