Explotación de la promiscuidad del sustrato para desarrollar sondas basadas en la actividad de las enzimas de la...

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Biología molecular
• La epigenética

Sus antecedentes:

• Las enzimas de translocación diez-once (TET) son cruciales para la regulación epigenética, catalizando la oxidación de la 5-metilcitosina en el ADN.
• Las herramientas químicas existentes para sondear la actividad de TET son limitadas debido a los desafíos en el seguimiento de la reactividad dentro de sustratos complejos de ADN.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar nuevas herramientas químicas para el seguimiento directo de la actividad de las enzimas de translocación TET.
• Aprovechar la promiscuidad del sustrato de la enzima TET para desarrollar nuevos métodos de detección.

Principales métodos:

• Se ha investigado la actividad de la enzima TET en bases de citosina modificadas de 5 posiciones no naturales, específicamente 5-vinilcitosina (vC) y 5-etinilecitosina (eyC).
• Se han desarrollado métodos para etiquetar el producto de 5-formilmeticitosina a partir de la oxidación de vC para la lectura del punto final.
• Se utilizó la formación intermedia de ceteno a partir de la oxidación de eyC para atrapar covalentemente las isoformas activas de TET.

Principales resultados:

• Las enzimas TET oxidan promiscuamente el vC para formar 5-formilmetilcitosina, lo que permite un etiquetado eficiente y una lectura de actividad.
• La reacción de la enzima TET con el eyC genera un ceteno intermedio que atrapa selectivamente las isoformas activas de TET.
• Este método de captura es eficaz incluso dentro de lisatos celulares complejos, lo que permite la visualización directa de la actividad TET.

Conclusiones:

• La explotación de la promiscuidad del sustrato de la enzima TET proporciona un medio nuevo y esencial para rastrear directamente la actividad de TET.
• Estas herramientas químicas ofrecen un nuevo enfoque para estudiar la función TET in vitro e in vivo.
• Los métodos desarrollados mejoran la capacidad de investigar el papel de las enzimas TET en la regulación epigenética.