El editor de bases de citosina genera variantes sustanciales de un solo nucleótido fuera del objetivo en embriones de...

Área de la Ciencia:

• La genética
• Biología molecular
• La bioingeniería

Sus antecedentes:

• Las tecnologías de edición del genoma como CRISPR-Cas9 ofrecen potencial para el tratamiento de enfermedades genéticas mediante la corrección de mutaciones patógenas.
• La evaluación precisa de las mutaciones fuera del objetivo es crucial para la seguridad y eficacia de las aplicaciones de edición del genoma.
• Las variaciones genéticas individuales, como los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), complican la identificación de los verdaderos eventos de edición fuera del objetivo.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar y validar un método sensible para la detección de mutaciones fuera del objetivo en todo el genoma inducidas por herramientas de edición del genoma.
• Para comparar la fidelidad de diferentes editores de bases y CRISPR-Cas9 in vivo.
• Establecer un punto de referencia para las tasas de mutación fuera del objetivo en embriones tempranos de ratón.

Principales métodos:

• Desarrollo del análisis fuera del objetivo de todo el genoma mediante el método de inyección de embriones de dos células (GOTI).
• Edición de un blastómero en embriones de ratón en la etapa de dos células utilizando CRISPR-Cas9 o un editor de bases de adenina (ABAE) o un editor de bases de citosina (CBE).
• Secuenciación de todo el genoma de las células progenitoras a partir de blastómeros editados y no editados en el día embrionario 14.5 para identificar variantes de un solo nucleótido fuera del objetivo (SNV).

Principales resultados:

• GOTI detectó con éxito mutaciones fuera del objetivo en todo el genoma.
• La edición de CRISPR-Cas9 y ABAE dio lugar a raras SNV fuera del objetivo, con frecuencias comparables a las tasas de mutación espontánea.
• Los editores de bases de citosina (CBEs) indujeron SNV a frecuencias más de 20 veces más altas que las tasas espontáneas, lo que indica una menor fidelidad.

Conclusiones:

• GOTI es un método eficaz para evaluar las mutaciones fuera del objetivo en todo el genoma.
• CRISPR-Cas9 y ABAE demuestran una alta especificidad para la edición del genoma in vivo en embriones tempranos.
• Los editores de bases de citosina requieren una optimización adicional para mejorar su fidelidad y reducir las mutaciones no intencionadas fuera del objetivo.