Enfoque computacional-experimental combinado para explorar el mecanismo molecular de SaCas9 con un rango de...

Área de la Ciencia:

• Biotecnología
• Biología molecular
• La genómica

Sus antecedentes:

• La tecnología CRISPR está avanzando rápidamente, sin embargo, su biología fundamental requiere más investigación.
• Las herramientas de ingeniería CRISPR a menudo carecen de explicaciones mecanicistas para sus características mejoradas.
• Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) es adecuado para aplicaciones in vivo, pero tiene un largo requisito de motivo adyacente de protospacer (PAM).

Objetivo del estudio:

• Para investigar la dinámica molecular del reconocimiento PAM de SaCas9.
• Para aclarar el mecanismo de las mutaciones de KKH en SaCas9.
• Diseñar y validar nuevas variantes de SaCas9 con propiedades mejoradas.

Principales métodos:

• Simulación de dinámica molecular basada en la estructura.
• Análisis de perturbación de energía libre.
• Validación experimental dirigida de las variantes SaCas9.

Principales resultados:

• Reveló mecanismos dinámicos de reconocimiento de PAM en SaCas9.
• Elucidó la base molecular de las mutaciones de KKH.
• Mutantes SaCas9-NR y SaCas9-RL diseñados y validados con un rango de orientación ampliado y una mayor actividad en células de mamíferos.

Conclusiones:

• El estudio proporciona una comprensión dinámica del reconocimiento de SaCas9 PAM.
• El flujo de trabajo desarrollado permite el diseño racional de variantes de Cas9 con nuevas propiedades.
• Las nuevas variantes de SaCas9 ofrecen herramientas mejoradas para aplicaciones de edición de genes.