Detección imparcial de objetos fuera del objetivo de CRISPR in vivo utilizando DISCOVER-Seq

Área de la Ciencia:

• Biología molecular
• La genómica
• Biotecnología

Sus antecedentes:

• La edición del genoma CRISPR-Cas se dirige con precisión al ADN, pero puede causar mutaciones no deseadas fuera del objetivo.
• Los métodos existentes para detectar efectos fuera del objetivo se limitan al ADN purificado o a modelos celulares específicos, que carecen de aplicabilidad in vivo.
• La identificación directa de sitios fuera del objetivo in vivo es crucial para la seguridad y eficacia de las terapias de edición del genoma.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un enfoque imparcial y universalmente aplicable para identificar los sitios fuera del objetivo de CRISPR-Cas directamente in vivo.
• Aprovechar el reclutamiento de factores de reparación del ADN para detectar la actividad de Cas con resolución de una sola base.
• Permitir la caracterización de nuevas herramientas de edición y facilitar el análisis fuera del objetivo específico del paciente.

Principales métodos:

• Desarrolló DISCOVER-Seq (descubrimiento in situ de objetos fuera del objetivo y verificación mediante secuenciación), un nuevo método para la identificación imparcial de objetos fuera del objetivo.
• Utilizó el reclutamiento del factor de reparación de ADN MRE11 para identificar la actividad de Cas y los sitios fuera del objetivo.
• Valida el enfoque a través de varias líneas celulares, células madre pluripotentes inducidas por el paciente y modelos de ratón in vivo.

Principales resultados:

• DISCOVER-Seq permite la detección directa, in vivo, de los sitios fuera del objetivo de CRISPR-Cas.
• El reclutamiento de MRE11 de seguimiento proporciona una resolución de base única de la actividad de Cas y las ubicaciones fuera del objetivo.
• El método es compatible con diversos formatos de ARN guía y tipos de enzimas Cas, lo que facilita la evaluación de nuevas herramientas de edición del genoma.
• Los sitios fuera del objetivo se identificaron con éxito en líneas celulares, iPSC y durante la edición in vivo en ratones.

Conclusiones:

• DISCOVER-Seq ofrece una solución universalmente aplicable para el descubrimiento imparcial in vivo fuera del objetivo en la edición del genoma.
• Esta tecnología permite la caracterización precisa de la actividad de Cas y la identificación de mutaciones fuera del objetivo a nivel molecular.
• DISCOVER-Seq allana el camino para el análisis in situ fuera del objetivo en pacientes individuales, crucial para avanzar en la seguridad y aplicación terapéutica de la edición del genoma.