Espacio de conformación de un exportador ABC heterodimérico en condiciones de volumen de negocios

Área de la Ciencia:

• Biología estructural
• La bioquímica
• Dinámica de las proteínas de la membrana

Sus antecedentes:

• Los exportadores de casete de unión de ATP (ABC) son proteínas de membrana dinámicas cruciales para los procesos celulares, la inmunidad y la resistencia a los medicamentos.
• La comprensión de los cambios conformacionales de los exportadores asimétricos ABC durante su ciclo funcional es vital, pero sigue siendo poco resuelta.
• Estos transportadores extruden diversas sustancias del citosol, impactando las funciones celulares y los estados de enfermedad.

Objetivo del estudio:

• Para delinear el ciclo funcional completo de un exportador de ABC asimétrico utilizando la criomicroscopia electrónica de alta resolución (crio-EM).
• Para resolver el acoplamiento de la unión de nucleótidos, la hidrólisis y la liberación a la dinámica conformacional en estos transportadores.
• Capturar y caracterizar los estados intermedios transitorios del ciclo de translocación del sustrato.

Principales métodos:

• Se utilizaron ocho estructuras de microscopía crioelectrónica (cryo-EM) de alta resolución.
• Exportador de ABC analizado en condiciones de rotación activa en un entorno de lípidos.
• Utilizó modulación mutacional y química para atrapar intermediarios cinéticos clave.

Principales resultados:

• Se han capturado distintas conformaciones orientadas hacia adentro (IF), incluida una con un sustrato peptídico unido.
• Se identificaron nuevos estados asimétricos post-hidrólisis con dominios de unión de nucleótidos dimerizados y una puerta extracelular cerrada.
• Se resolvió una conformación abierta orientada hacia el exterior (OF) mediante la modulación de las tasas de hidrólisis de ATP, revelando su naturaleza transitoria.
• Se demostró que los estados de prehidrólisis unidos al ATP y los atrapados por el vanadato son conformacionalmente equivalentes, mostrando estados de OF coexistentes.
• Se observó oclusión asimétrica de ATP y ADP en estados post-hidrólisis, con separación progresiva del dominio de unión de nucleótidos y desbloqueo de la puerta intracelular.
• Se estableció que la liberación de fosfato, en lugar de la hidrólisis de ATP, desencadena el retorno a la conformación IF.

Conclusiones:

• La liberación de fosfato es el desencadenante clave para el retorno conformacional de los exportadores asimétricos ABC al estado orientado hacia adentro.
• El estudio resolvió los pasos fundamentales en el ciclo de translocación del sustrato de los transportadores ABC asimétricos mediante el mapeo de su paisaje conformacional.
• Cryo-EM, combinado con la modulación cinética, proporciona una visión sin precedentes de los mecanismos funcionales dinámicos de estas proteínas esenciales de la membrana.