General Base Swap Preserva la actividad y amplía la tolerancia del sustrato en el procesamiento automático de...

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Biología molecular
• Ingeniería de enzimas

Sus antecedentes:

• La señalización del erizo (Hh) es crucial para el desarrollo y se basa en el autoprocesamiento de la proteína precursora Hh.
• Este autoprocesamiento implica la modificación del colesterol, catalizado por un aspartato del sitio activo (D46) que actúa como una base general.

Objetivo del estudio:

• Para investigar el papel catalítico de D46 en el procesamiento automático de Hh.
• Caracterizar un mutante D46H por sus efectos sobre la actividad de colesterilación, la especificidad del sustrato y la conformación del sitio activo.

Principales métodos:

• Se utilizó un ensayo de autoprocesamiento continuo basado en FRET para estudios in vitro.
• Expresión estable empleada en células 293T humanas para la validación en celulosa.
• Se aplicó la espectroscopia de RMN para determinar los valores de pKa de los residuos.

Principales resultados:

• El mutante D46H mantuvo una actividad de colesterilización nativa comparable a la del tipo salvaje (WT), con una eficiencia catalítica (kmax/KM) y pKa similares.
• D46H demostró una tolerancia significativamente expandida al sustrato, mostrando una eficiencia > 200 veces y > 300 veces mayor para el coprostanol y el epicoprostanol, respectivamente.
• La conformación del sitio activo se conservó en el mutante D46H.

Conclusiones:

• La mutación D46H representa la primera instancia de una sustitución de base general Asp-to-His que conserva tanto la estructura de la proteína como la actividad general de la base.
• La tolerancia expandida del sustrato en D46H se atribuye a la estabilización electrostática del intermedio tetraédrico por H46.
• Los hallazgos proporcionan información fundamental sobre el autoprocesamiento de Hh y tienen implicaciones para la ingeniería de proteínas y el diseño de enzimas.