Adaptación de la triptófano sintasa TrpB para la formación selectiva de enlaces cuaternarios de carbono

Área de la Ciencia:

• Biocatálisis
• Ingeniería de enzimas
• Síntesis orgánica

Sus antecedentes:

• La triptófano sintasa (TrpB) cataliza naturalmente la L-serina y la condensación del indol en L-triptófano.
• Los esfuerzos de ingeniería anteriores permitieron a TrpB sintetizar aminoácidos no canónicos.
• La creación de estereocentros cuaternarios sigue siendo un desafío en la química sintética.

Objetivo del estudio:

• Diseñar TrpB para la formación de enlaces C-C con oxíndolos 3-sustituidos.
• Desarrollar una enzima capaz de generar nuevos estereocentros cuaternarios.
• Para expandir la utilidad de TrpB diseñado para sintetizar diversos aminoácidos no canónicos.

Principales métodos:

• Evolución dirigida de la enzima TrpB durante seis generaciones.
• Utilizando como sustratos oxindoles 3-sustituidos, con y sin protección N1.
• Utilizando la difracción de electrones de microcristales (MicroED) para la determinación de la configuración del estereocentro.

Principales resultados:

• La variante TrpB diseñada, TrpB Pf_quat, exhibe un aumento de actividad de 400 veces para la alquilación de oxindoles sustituidos por 3.
• La enzima forma selectivamente estereocentros cuaternarios de todo carbono en la posición gamma de los productos de aminoácidos.
• TrpB Pf_quat demuestra regioselectividad para los carbonos terciarios en las lactonas y las cetonas.
• Alta termostabilidad de las enzimas y niveles de expresión (> 500 mg/L en cultivos de E. coli).

Conclusiones:

• TrpB Pf_quat proporciona una plataforma biocatalítica eficiente y sostenible para la construcción de aminoácidos no canónicos con estereocentros cuaternarios de todo carbono.
• La enzima modificada amplía el alcance de la formación de enlaces C-C en el biocatálisis.
• El análisis de MicroED confirmó la estereoquímica de los estereocentros recién formados.