Perfilamiento por fotoproximidad de las interacciones proteína-proteína en las células

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Biología celular
• Biología Química

Sus antecedentes:

• El mapeo de las interacciones proteína-proteína (IPP) es crucial para comprender los mecanismos celulares.
• Los métodos existentes a menudo carecen de resolución temporal o de la capacidad de perfilar las interacciones en células vivas.
• Las proteínas sensibles al redox como KEAP1 juegan un papel clave en la señalización celular y las respuestas al estrés, pero sus redes de interacción dinámica no se comprenden completamente.

Objetivo del estudio:

• Introducir un nuevo método de elaboración de perfiles de interacción con las proteínas por fotoproximidad (PhotoPPI).
• Permitir el mapeo de los IPP in vitro y en células vivas con alta resolución temporal.
• Investigar la red de interacción dinámica de la proteína sensor regulada por redox KEAP1 en células vivas.

Principales métodos:

• Desarrollo de una sonda química bioortogonal y multifuncional para el etiquetado de proteínas específicas.
• Utilizando una interacción covalente SNAP-Tag/benzilguanina para la orientación de la sonda.
• Utilizando una sonda activada por luz (PP1) que libera un nucleófilo de carbenos para el etiquetado proximal.
• Integración con la cromatografía líquida cuantitativa y la espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para el mapeo imparcial de las interacciones.

Principales resultados:

• Se ha demostrado la carga fácil de la sonda y el etiquetado dependiente de la interacción y la luz in vitro.
• Mapeado con éxito las interacciones de KEAP1 en células vivas, identificando socios de unión conocidos y nuevos como PGAM5 y HK2 en condiciones basales.
• Se revelaron cambios significativos en las interacciones de KEAP1 bajo estrés metabólico o redox, incluida la asociación con proteínas de tráfico lisosomal (por ejemplo, SQSTM1, CTSD, LGMN).

Conclusiones:

• PhotoPPI es un nuevo y poderoso método para mapear las interacciones dinámicas proteína-proteína en células vivas.
• El estudio proporciona información sin precedentes sobre la red de interacción dinámica de KEAP1, particularmente su respuesta al estrés celular.
• PhotoPPI permite el seguimiento de la "red social" de las proteínas sensibles al redox con alta resolución temporal.