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Una deshidrogenasa de malato específica y altamente activa mediante el rediseño de un marco de deshidrogenasa de
Science (New York, N.Y.)
|December 16, 1988
Resumen
Los investigadores modificaron la deshidrogenasa del lactato de Bacillus stearothermophilus para aceptar el malato como sustrato. La variante Gln102----Arg creó una enzima efectiva para el malato, demostrando una exitosa ingeniería de especificidad de sustrato.
Área de la Ciencia:
- La ingeniería enzimática es la ingeniería de enzimas.
- Las relaciones entre la estructura y la función de las proteínas.
- La biocatálisis por biocatálisis.
Sus antecedentes:
- La L-lactato deshidrogenasa (LDH) dependiente del nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) generalmente cataliza la oxidación del lactato.
- La modificación de los sitios activos de la enzima puede alterar la especificidad del sustrato.
- Bacillus stearothermophilus proporciona un sistema modelo para el estudio de la evolución de las enzimas.
Objetivo del estudio:
- Para diseñar una nueva enzima con actividad de malato deshidrogenasa a partir de un andamio de L-lactato deshidrogenasa.
- Para investigar los efectos de las sustituciones de aminoácidos específicos en la especificidad del sustrato de la enzima.
- Para crear un biocatalizador altamente eficiente para la conversión de malato.
Principales métodos:
- Se utilizó la mutagénesis dirigida al sitio para introducir tres sustituciones específicas de aminoácidos (Asp197Asn, Thr246Gly, Gln102Arg) en la deshidrogenasa L-lactato de Bacillus stearothermophilus.
- Se analizó la cinética de la enzima para determinar la especificidad del sustrato y la eficiencia catalítica (kcat/Km) para el oxaloacetato.
- El rendimiento de la enzima diseñada se comparó con el malato nativo y las lactato deshidrogenasas.
Principales resultados:
- Las tres mutaciones cambiaron la preferencia del sustrato hacia el malato.
- La variante Gln102Arg exhibió una actividad y especificidad significativas de la malato deshidrogenasa.
- Esta enzima de ingeniería logró una kcat/Km para el oxaloacetato comparable a la LDH nativa para el piruvato (4.2 x 10^6 M^-1 s^-1).
- La velocidad máxima (250 s^-1) para la enzima diseñada fue el doble que la de la malato deshidrogenasa nativa.
Conclusiones:
- La ingeniería del sitio activo de la enzima puede redirigir con éxito la especificidad del sustrato.
- La mutación Gln102Arg es un determinante clave para lograr la actividad de la malato deshidrogenasa en este andamio de LDH.
- Este estudio demuestra el potencial para crear nuevos biocatalizadores a través del diseño racional de enzimas.