Perturbaciones generales del genoma a través de la adaptación CRISPR revelan una genética compleja de sensibilidad a...

Área de la Ciencia:

• Biología molecular
• La genética
• Microbiología

Sus antecedentes:

• Las pantallas CRISPR de todo el genoma son potentes para los estudios de función génica, pero están limitadas por las costosas bibliotecas de ARN guía de baja diversidad.
• Los métodos actuales para sintetizar ARN guía son costosos, requieren mucho tiempo y mucha mano de obra.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un método novedoso y rentable para generar bibliotecas de interferencia CRISPR (CRISPRi) de gran diversidad.
• Mejorar la sensibilidad y el alcance del cribado CRISPR para identificar nuevos determinantes genéticos, como la resistencia a los antibióticos.

Principales métodos:

• Utilizó el mecanismo de adaptación de Streptococcus pyogenes CRISPR-Cas para desarrollar la fabricación de bibliotecas mediadas por adaptación CRISPR (CALM).
• CALM emplea células bacterianas como fábricas para producir cientos de miles de crRNAs distintos dirigidos al 95% de los sitios genómicos.
• Se utilizó la adaptación iterativa de CRISPR para generar bibliotecas de doble crRNA para estudiar perturbaciones de doble gen.

Principales resultados:

• Generó bibliotecas CRISPRi muy completas con un promedio de más de 100 crRNAs distintos por gen, lo que permite un análisis de represión transcripcional matizado.
• Se descubrieron con éxito nuevos determinantes de resistencia a los antibióticos a través de la detección mejorada de CRISPRi.
• Creó más de 100,000 perturbaciones de doble gen utilizando CALM iterativo, revelando ideas sobre la contingencia histórica de la evolución de la resistencia a los antibióticos.
• CALM elude la síntesis y clonación tradicionales de gRNA, lo que permite la generación de bibliotecas en bacterias de tipo salvaje.

Conclusiones:

• CALM ofrece un enfoque escalable, rentable y eficiente para generar diversas bibliotecas CRISPRi.
• Este método mejora significativamente la sensibilidad y aplicabilidad de las pantallas CRISPR para el descubrimiento genético, particularmente en sistemas bacterianos difíciles.
• CALM facilita el estudio de interacciones genéticas complejas y procesos evolutivos, como la adquisición gradual de resistencia a los antibióticos.