Orientación del genoma sin restricciones con variantes de CRISPR-Cas9 diseñadas casi sin PAM

Área de la Ciencia:

• Biología molecular
• La genética
• Biotecnología

Sus antecedentes:

• La edición del gen CRISPR-Cas9 se basa en el reconocimiento del motivo adyacente del protospacer (PAM).
• Este requisito PAM restringe las secuencias de ADN objetivo disponibles para la manipulación del genoma.
• Los sistemas CRISPR-Cas9 existentes, como *Streptococcus pyogenes* Cas9 (SpCas9), están limitados por sus secuencias PAM específicas (por ejemplo, NGG).

Objetivo del estudio:

• Para diseñar variantes SpCas9 que eliminen o reduzcan la dependencia del NGG PAM canónico.
• Ampliar el rango de orientación de CRISPR-Cas9 para aplicaciones de edición de genoma más amplias.
• Desarrollar nuevas herramientas para generar variantes genéticas anteriormente inaccesibles, incluidas las relevantes para las enfermedades.

Principales métodos:

• Ingeniería de proteínas de SpCas9 para crear variantes con especificidades alteradas de PAM.
• Desarrollo de la variante SpG dirigida a los NGN PAM.
• Optimización adicional para crear la variante SpRY, dirigida a los PAM NRN y NYN.
• Ensayos para evaluar las actividades de las nucleasas y los editores de bases de SpG y SpRY en células humanas.

Principales resultados:

• La variante SpG diseñada se dirige con éxito a las secuencias NGN PAM.
• La variante desarrollada de SpRY exhibe una amplia orientación PAM, incluidos los motivos NRN y NYN.
• SpRY mostró una actividad robusta en los sitios de NRN PAM y una actividad sustancial en los sitios de NYN PAM en células humanas.
• SpG y SpRY permitieron la generación de variantes genéticas relevantes para la enfermedad no alcanzables con SpCas9 de tipo salvaje.

Conclusiones:

• SpG y SpRY amplían significativamente el alcance de la tecnología CRISPR-Cas9.
• Estas variantes de ingeniería superan las limitaciones de PAM, lo que permite la edición del genoma de alta resolución.
• Las herramientas desarrolladas son valiosas para diversas aplicaciones, incluido el estudio de enfermedades genéticas.