Probe de ubiquitina fotocageada y permeable a las células para el perfilamiento temporal de enzimas desubiquitinantes

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Biología celular
• Biología Química

Sus antecedentes:

• Las enzimas desubiquitinantes (DUB) regulan los procesos celulares cruciales.
• El perfil de la actividad DUB requiere herramientas con control temporal.
• Los métodos existentes carecen de una resolución temporal precisa para el mapeo de la actividad DUB.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar y validar una nueva sonda de ubiquitina fotoenjaulada y permeable a las células.
• Para permitir el perfilamiento espacio-temporal de la actividad DUB dentro de las células vivas.
• Investigar el compromiso de DUB durante fases específicas del ciclo celular.

Principales métodos:

• Un enfoque semisintético para crear una sonda de ubiquitina con una ojiva de tetrazol.
• Utilizó un péptido de penetración celular de poliarginina cíclica (cR10) para la administración celular.
• La fotoactivación mediante luz UV de 365 nm desencadenada in situ para la formación de nitrilimina para el etiquetado de DUB.
• Espectrometría de masas cuantitativa sin etiqueta (LFQ) para la identificación de DUB en células intactas.

Principales resultados:

• La sonda demostró reactividad con DUBs purificados (USP2, UCHL1, UCHL3) después de la fotoactivación.
• Se observó una rotulación robusta de los DUB en los lisados celulares HeLa y en las células intactas después de la irradiación UV.
• Se capturaron DUBs específicos durante las fases G1/S y G2/M en células HeLa sincronizadas.
• El perfil temporal reveló actividad dinámica de DUB después de la liberación del ciclo celular.

Conclusiones:

• La sonda de ubiquitina fotocageable para células es una herramienta valiosa para el perfil temporal de DUB.
• Esta sonda facilita una comprensión más profunda de las funciones DUB en los procesos celulares.
• La metodología permite un mapeo preciso de la actividad DUB en contextos celulares específicos.